martes, 15 de enero de 2013

ANÁLISIS SEMINAL 
EQUINO Y BOVINO

El análisis seminal tiene como objetivos predecir la fertilidad y capacidad fecundante del futuro semental y evaluar el semen durante los procesos de criopreservación.

ANÁLISIS SEMINAL BÁSICO:

El método más empleado en la recogida de semen para estas especies es la vagina artificial (coito ficticio), la cual permite obtener una muestra de eyaculado similar a la de la monta natural (condiciones higiénicas).

Volumen:

Se registra el volumen de semen filtrado, libre de gel (equino). El volumen oscila entre 20-150 ml (equino), y 5-8 ml (bovino). Existen importantes variaciones en función del individuo, raza, régimen sexual, estación del año, método de recogida, etc.[2]

Color:

Varía desde blanco acuoso a crema en función de la concentración espermática. Coloraciones anormales indicarían contaminaciones: orina, sangre, etc.[1]

pH:

Evaluación inmediatamente después de la recogida seminal (pHmetro/tiras de pH). Entre 7,2-7,6 en equino, y 6,4-7,8 en bovino. Está inversamente relacionado con la concentración espermática. El metabolismo espermático acidifica el medio y presencia de sustancias contaminantes como la orina y procesos inflamatorios le dan valores más altos[2].

Concentración espermática:

Permite evaluar la capacidad de producción de espermatozoides del semental y calcular el número de dosis a producir por eyaculado. Existe correlación entre la concentración y fertilidad[5]. Se observan variaciones en función del individuo, estación del año, frecuencia y técnica de recogida, etc., si bien la concentración media está entre 60-350 x106 (equino) y 800-1000 x106 (bovino) espermatozoides/ml[2]. Entre los diferentes métodos de evaluación:
  • Cámaras de recuento celular: Neubauer /Thoma. Contaje manual.
  • Espectrofotómetro: relaciona el grado de absorción de la luz que provocan los espermatozoides diluidos      a una concentración conocida, con la concentración de la muestra. Rápido y con menor coeficiente de variación que el anterior (2.9%  vs. 12.3%)[6]  pero los valores pueden verse afectados por contaminaciones.
  • Contadores celulares electrónicos: cuentan partículas con un tamaño prefijado.
  • Sistemas CASA (Computer Assisted Sperm Analysis).

Motilidad espermática:

Proporciona los datos más importantes sobre calidad y vialidad de una muestra espermática. Se evalúa (referente a bovino y equino):
  •   Movimiento total: porcentaje de espermatozoides mótiles. (60% a 90%)[2]. En bovino, debido a la elevada concentración espermática, se habla de motilidad masal (escala de 1 a 5, evaluando como 1 al semen que no presenta ondas y 5 cuando las ondas se mueven rápidamente formando remolinos).
  •  Movimiento progresivo (motilidad individual): porcentaje de espermatozoides con trayectoria progresiva en línea recta. El rango posible comprende desde un 40% a un 90%, siendo el valor mínimo aceptable del 50%[2].
  •   Vigor de movimiento. Se evalúa al mismo tiempo que la motilidad individual, teniendo en cuenta la velocidad con la que estos espermatozoides atraviesan el campo. La escala que se utiliza es de 0 a 5 (rangos posibles), evaluando como 0 los espermatozoides inmóviles y como 5 los que avanzan rápidamente por el campo y son difíciles de seguir visualmente.[7].

La valoración debe realizarse con el semen diluido. El diluyente se agrega al eyaculado (libre de gel en el caso del equino), previamente atemperado a 37º C. Los componentes del diluyente proveen al semen sustratos energéticos para su supervivencia y motilidad, tienen la capacidad de amortiguar el pH, controlando la acidez, y de mantener una presión osmótica adecuada, contienen macromoléculas que lo protegen contra el shock frío (yema de huevo, leche) y antibióticos que reducen la proliferación bacteriana. Si el semen va a ser congelado, el diluyente contendrá agentes crioprotectores. Diluciones bajas tipo 1:1 (semen:diluyente) no son adecuadas para preservar el semen. El nivel de dilución debe hacerse en función de la concentración inicial de la muestra espermática (25 a 50 x10 espermatozoides/ml en equino). Concentraciones muy altas hacen que los espermatozoides compitan por los nutrientes y aumenta el nivel de metabolitos en el medio, por lo tanto disminuye su longevidad.
  Además, dicha valoración debe llevarse a cabo en un medio adecuado y controlando la temperatura de las superficies que entran en contacto con la muestra (37 ºC). Es una valoración subjetiva bajo microscopía óptica de una muestra de 10 µl[6].

Longevidad de la motilidad espermática:

Valoración de la motilidad a diferentes tiempos (12, 24, 48 y 72 horas) y temperaturas (corporal y de refrigeración a 4 ºC)[6]. Esta prueba permite determinar la viabilidad del semen en el tracto de la hembra, así como su calidad y viabilidad tras la refrigeración. La longevidad espermática a la refrigeración guarda gran correlación con la capacidad de congelación del semen.

      El factor dilución es determinante en la longevidad del semen (debido a los componentes incluidos en el diluyente), de forma que a mayor dilución mayor longevidad (manteniendo un mínimo de espermatozoides por dosis). El esperma puro mantendrá espermatozoides móviles hasta 18-24 horas, mientras que el fresco diluido lo hará hasta las 48 horas[7].
              
     Mediante la dilución de la muestra seminal conseguimos aumentar la longevidad porque disminuimos el efecto negativo del plasma seminal. La presencia del plasma seminal disminuye el tiempo de supervivencia del semen refrigerado porque en el momento siguiente a la recogida los espermatozoides presentan un metabolismo muy elevado y el plasma seminal tiene una baja capacidad de protección. Debido a la variabilidad individual en la composición del plasma seminal entre caballos puede ser necesaria la centrifugación en sementales considerados como “malos refrigeradores” y en aquellos con bajas concentraciones de espermatozoides (< 100x10 espermatozoides/ml). 
     
        Estudios en porcino revelan que la bacteriospermia es un hallazgo frecuente en el semen diluido (resistencias, componentes nutritivos de los diluyentes, temperaturas) y puede resultar en detrimento de la longevidad y calidad del semen, si esta no es controlada (Althouse y Lu, 2005). Los procesos de recolección, dilución e inseminación deben ser realizados conservando las mejores condiciones higiénicas para, de esta manera, no interferir en la fertilidad (Martínez, 1998; Thacker et al., 1984; Toniolli et al., 2002)[8].

Morfología espermática:

Se basa en la relación directa existente entre la proporción de espermatozoides anormales en el eyaculado, el tipo de defecto y su relación con la fertilidad in vivo[5]. La evaluación de las anomalías morfológicas puede realizarse sobre preparaciones húmedas o fijadas en un portaobjetos. El rango de presencia de anomalías en un semen de calidad está entre 10% y 25%[2]. Altos porcentajes se asocian a inmadurez sexual, procesos degenerativos y patológicos y un alto régimen de recogidas.
Mayoritariamente, las anomalías se clasifican en:
  • Primarias: de origen testicular, producidas durante la espermatogénesis. Corresponden a anomalías de la cabeza, pieza intermedia o inserción de la cola.
o       Específicas: de origen genético. Pueden afectar a cualquier estructura espermática.
o       No específicas.
Morfologia espermática del semen de caballo: a)normal; b)acrosoma desprendido,
c)inserción abaxial, 
d)gota citoplasmática,
e)anomalías de la pieza 
intermedia, g)anomalías de la cola.
  • Secundarias:  desarrolladas en el epidídimo a lo largo del proceso de maduración espermática, suelen corresponder a presencia de gotas citoplasmáticas. Afectan fundamentalmente a la cola del espermatozoide.
  • Terciarias: originadas por manipulación incorrecta del semen tras la recolección.                    

ANÁLISIS SEMINALES ALTERNATIVOS:

Algunos machos pueden mostrar bajos índices de fertilidad a pesar de presentar un seminograma normal. En estos casos se recomienda recurrir a pruebas alternativas para estudiar otros parámetros.

Vitalidad espermática:

    Se valora indirectamente mediante la integridad de la membrana plasmática.  El estudio se hace mediante tinciones:

- Tinciones no fluorescentes:


o    Eosina – nigrosina: permite diferenciar entre espermatozoides vivos (no teñidos) y muertos (color rojizo por la penetración de eosina al existir pérdida de la continuidad de la membrana).

o       Tripán azul: vivos (no teñidos) y muertos (teñidos de azul).


- Tinciones fluorescentes: uno de los fluorocromos más utilizados para identificar células muertas es el Ioduro de Propidio (PI). Este compuesto entra en espermatozoides con la membrana plasmática dañada, se une al núcleo y, al ser excitado por una longitud de onda de entre 510-560 nm, emite fluorescencia roja. Además existen otros marcadores fluorescentes específicos para células muertas cuyo mecanismo de acción es similar, como el Hoechst 33258, el bromuro de etidio o la hidroetidina (HED). El SYBR-14 suele utilizarse en combinación con PI, y distingue dos poblaciones espermáticas, una de ellas constituida por células muertas o en estado de degeneración, cuyas membranas plasmáticas son permeables al PI (emiten fluorescencia roja); y la otra constituida por espermatozoides viables, cuyas membranas intactas son impermeables al PI pero dejan entrar el SYBR-14, y por tanto emiten fluorescencia verde. Un fluorocromo con un mecanismo de acción similar al del SYBR-14, capaz de identificar espermatozoides vivos, es el Hoechst 33342. Este compuesto también entra en células vivas y se une al ADN espermático, sin embargo, su uso está limitado por la longitud de onda de su espectro de excitación, que está en el rango UV. La mayoría de los citómetros disponen de un láser con una longitud de onda de 488 nm, y para evaluar las muestras marcadas con Hoechst 33342, es preciso disponer de un láser de menor longitud de onda[3].
Mediante la tinción con naranja de acridina (método SCSA –Sperm Chromatin Structure Assay-), podemos estudiar el grado de desnaturalización de la cromatina de los espermatozoides: emisión de fluorescencia roja cuando se une al ADN desnaturalizado y verde cuando se une al ADN normal de un espermatozoide intacto. Cuanto mayor sea el cociente fluorescencia roja/fluorescencia total, la probabilidad de conseguir una gestación a término es menor.

Integridad del acrosoma:

El acrosoma es fundamental en el proceso de fecundación. Especialmente importante tras la descongelación ya que el espermatozoide sufre daños a nivel acrosomal durante dicho proceso[6].
Una técnica a seguir pude ser la triple tinción, que permite valorar la vitalidad y el estatus acrosomal al mediante el empleo de tripán azul (colorante vital), marrón de Bismark (colorante postacrosómico) y rosa de Bengala (colorante acrosómico).
  Además de la triple tinción, se emplea la tinción eosina/verde rápido, Giemsa, eosina/nigrosina y otras tinciones dobles. La valoración de los espermatozoides, incluso de especies cuyo tamaño es relativamente pequeño (équidos, porcino, entre otras), se puede realizar mediante un microscópio óptico de contraste de fases con objetivo de 60x[5].
          La citometría de flujo también permite valorar la integridad acrosomal, además de la funcionalidad mitocondrial y el estado de capacitación de los espermatozoides, así como la obtención de muestras de espermatozoides sexados (bovino)[4]. Tiene el inconveniente de que se necesita disponer de un citómetro (coste).
Cuando se utiliza la citometría de flujo como método de análisis, la integridad acrosomal se valora mediante una lecitina conjugada con un fluorocromo. Las lecitinas más frecuentes son la PNA (peanut agglutinin), que se une a la membrana acrosomal externa (en su cara interna), y la PSA (pisum sativum agglutinin), que se une a la matriz acrosomal y la membrana acrosomal externa. Los espermatozoides con al membrana dañada, posibilitan el paso de la lecitina conjugada al compartimento acrosomal[3].
Otra posibilidad para identificar la presencia de alteraciones acrosomales es el uso de anticuerpos monoclonales, marcados con un fluorocromo, frente a moléculas específicas del contenido acrosomal[4].
Para valorar simultáneamente el estado del acrosoma y la viabilidad, se pueden combinar tres fluorocromos (SYBR-14 y PI, para viabilidad; PNA, para integridad acrosomal)[3].

Análisis morfométrico computerizado:

Permite una valoración morfológica objetiva usándose equipos de análisis de imagen computerizados (sistemas CASA). Existe relación entre alteraciones morfométricas importantes de los espermatozoides y problemas de fertilidad. Además permite valorar los cambios morfológicos producidos tras la descongelación[4].

Análisis computerizados de motilidad espermática:

Mediante el uso del sistema CASA es posible valorar de forma objetiva la motilidad seminal. Permite la obtención de parámetros como el porcentaje de espermatozoides móviles, velocidad curvilínea (VCL), rectilínea (VSL), media (VAP), índice de linearidad, rectitud, oscilación, amplitud del desplazamiento lateral de la cabeza, frecuencia del batido del flagelo, etc. También identifica la existencia de subpoblaciones espermáticas con distintos patrones de movimiento que coexisten en la misma muestra, lo cual es una visión más real que la motilidad media, puesto que, un eyaculado está constituido por una población heterogénea de espermatozoides. La presencia de estas subpoblaciones podría sugerir la existencia de alguna relación entre cambios en la estructura subpoblacional de una muestra y su capacidad fecundante[4].

Test de resistencia osmótica:

 Valora la integridad de la membrana plasmática a través de su capacidad para intercambiar líquidos. El más utilizado es el HOST (hipoosmotic swelling test). Cuando un espermatozoide intacto se somete a una solución hipoosmótica responde incorporando agua a su medio intracelular y se evidencia por un enrollamiento de su cola[5].
  
a)endósmosis negativa, b-g)distintas manifestaciones de endósmosis positiva.

Otras pruebas:

·     Test bioquímicos: la producción de L-Lactato valora el metabolismo energético de los espermatozoides.
·    Valoración de enzimas: GOT, LDH, hialuronidasa. Su valoración en el plasma seminal indica el grado de daño del acrosoma y membrana plasmática.
·      Microscopía electrónica.
·      Test de penetración heteróloga.
·      Valoración de receptores de progesterona en la membrana plasmática.
·      Análisis de plasma seminal.

DISCUSIÓN:

Ø  Las cualidades que deben tener los espermatozoides de un eyaculado son motilidad progresiva, morfología normal, integridad estructural y funcional de la membrana, metabolismo activo, enzimas asociadas con la fecundación, capacidad de penetración y transferencia óptima del material genético, sin embargo existe dificultad en el análisis integral, por la complejidad de la función espermática[5].
Ø     La existencia de un número tan elevado de test pone de manifiesto que ninguno de ellos es válido por sí mismo[6]. Por ello el uso combinado del análisis seminal básico con alguna prueba alternativa aumenta la efectividad y la veracidad en la estimación de la calidad de un semen fresco así como crioconservado.
Ø  Para cumplir su función satisfactoriamente, el semental debe reunir ciertas características de buena cantidad y calidad de semen, libido y capacidad de monta. Un pedigree valioso y/o una conformación ideal valen poco si el macho no es eficiente preñando hembras.
Ø    Debemos de tener en cuenta que los toros de razas de carne alcanzan la pubertad más tarde que los de razas de leche (18 meses en vez de 14); además los eyaculados de toros jóvenes tendrán un volumen más bajo y por lo general una menor concentración que los toros maduros. Los equinos también presentan variaciones dependiendo de la raza, y en comparación con el bovino, presentan un volumen mayor de eyaculado y una menor concentración espermática. Éstos, además presentan la peculiaridad de excretar un gel (tapioca) que se filtrará para su eliminación en el momento de la recogida.
ØEl conocimiento de la fertilidad o de la capacidad fecundante de cada semental, se convierte en unos de los principales objetivos en la producción de semen bovino o equino. En el caso del bovino, un requisito indispensable para el desarrollo de esta biotecnología, es que el semen utilizado mantenga su capacidad de fertilidad después de haber sido criopreservado[5].

BIBLIOGRAFÍA:

[1] Bearden, H. J., Fuquay, J. W. Evaluación del semen. En: Reproducción animal aplicada. México, D.F.: El Manual Moderno, S. A. de C. V., 1982: 153-185.
[2] Gómez-Cuétara, C. El examen de compra en los sementales. Equine Medicine. Improve Ibérica. Módulo 13 (01/10/2011).
[3] Muiño, R. Evaluación de la motilidad y vialidad del semen bovino mediante el uso de sistemas CASA y citometría de flujo: identificación de subpoblaciones espermáticas. Tesis doctoral. Universidad de Santiago de Compostela. Facultad de Veterinaria. Disponible en: http://dspace.usc.es/bitstream/10347/2406/1/9788497509886_content.pdf. Descarga: enero 2013.
[4] Muiño, R., Fernández, M., Areán, H., Viana, J.L., López, M., Fernández, A., Peña, A.I. Nuevas tecnologías aplicadas al proceso y evaluación del semen bovino en centros de inseminación artificial. Itea (2005). Vol 101 (3). 175-191. Disponible en: http://www2.cita-aragon.es/citarea/bitstream/10532/1154/1/10532-1064_1.pdf. Descarga: enero 2013.
[5] Olegario, C., Tamargo, C., Díez, C. Análisis del semen bovino. Boletín informativo del SERIDA (Asturias), nº 2. 2012.
[6] Miró, J., Ocaña, M. El análisis seminal. Importancia, posibilidades y su relación con la fertilidad. Equinus. 2006. Nº 16. 53-68.
[7] http://www.uco.es/organiza/departamentos/medicina-cirugia/reproduccion/proyecto2. Acceso: enero 2013.

[8] Pineda, Y., Santander, J. Evaluación de la flora bacteriana del semen de verracos en granjas porcinas de Venezuela. Zootecnia Tropical, Vol. 25, No. 3, 2007, pp.173-177. Disponible en: http://www.bioline.org.br/request?zt07023. Descarga: enero 2013.

Autores:
González González, Jimena.
Martínez Martínez, Yaiza.
Sánchez Paniagua, Diana I.
                                    
Máster en Biología y Tecnología de la Reproducción
Universidad de Oviedo 2012-2013

6 comentarios:

  1. Felipe, tenemos que colocar aún la bibliografía en el texto. Lo haremos en la mayor brevedad posible. En el artículo divulgativo no vamos a citar dicha bibliografía, ya que la mayoría del texto procede de aportaciones personales y conocimientos adquiridos en los años de licenciatura.

    ResponderEliminar
  2. No hay problema, posiblemente no pueda volver a los trabajos hasta por la tarde. En el divulgativo, aunque no citéis en el texto, conviene que pongáis una sección de bibliografía. Podéis reseñar los libros u otras publicaciones (incluidas páginas web) que os hayan sido de utilidad para aprender sobre este tema.

    ResponderEliminar
  3. Habéis preparado todo un manual de evaluación rutinaria. Una cosilla, ¿los rangos a qué se refieren? Habláis de valores medios, pero lo que indicáis es un rango. Convendría que mostraseis una desviación, percentiles o un intervalo de confianza. Si son valores máximos y mínimos, deberíais indicarlo, pero no es buena idea utilizarlos (ya que realmente son los valores extremos, es decir, raros).

    Creo que mezcláis también lo que son los rangos deseables (en el apartado de motilidad, por ejemplo), con los rangos posibles (vigor). En algún caso, la terminología no es correcta. Por ejemplo, en el movimiento total y progresivo no se da el número total de espermatozoides, sino un porcentaje.

    A propósito, los índices que ponéis variarán entre especies. Deberíais indicar si os estáis refiriendo a una especie en concreto o si estáis condensando datos de varias. Tened en cuenta que en algunos casos eso no se puede hacer, ya que hay especies que difieren mucho en sus características seminales. ¿Tal vez podríais presentar una tabla comparativa? O podríais indicar al principio si vais a enfocarlo a una especie concreta, dando algún dato suelto de otras especies.

    El símbolo de grados Celsius es °C, no ° C.

    ¿Pensáis que si la muestra se diluye mucho la longevidad aumentará? ¿Es así en todas las especies? ¿Por qué al diluir se incrementa la longevidad?

    Cuando habláis de las anomalías, especificáis que las primarias son de origen testicular. ¿Y las secundarias? Hay también terciarias.

    En el caso de la tinción eosina-nigrosina deberíais indicar que el que tiñe es la eosina. El tripán azul es un colorante, no 2 (no lleva guión).

    Cuando habláis del naranja de acridina, tal vez deberíais decir que la probabilidad de conseguir una gestación a término es menor. No hay una relación tan directa, y "tasa de gestación" es un término un poco raro en ese contexto.

    Sobre la evaluación del acrosoma mediante contraste de fases, se puede hacer en muchas especies, no solo en bovino (el tamaño es similar en otros rumiantes). Si se dispone de un objetivo 60X se puede evaluar en especies con el espermatozoide más pequeño (caballo, cerdo).

    La PNA se une a la membrana acrosomal externa, solo que lo hacen por su cara interna. Creo que hay un error en Muiño, donde indica que se une a la membrana interna.

    ResponderEliminar
  4. Felipe, más o menos ya corregimos lo que nos indicaste. Igual de aquí a la tarde hacemos alguna modificación más, entre ellas cambiar la letra que no se por qué razón no se asemeja a la que teníamos en un principio.

    ResponderEliminar