16 de diciembre de 2013

ESPERMATOGÉNESIS EN CULTIVOS TRIDIMENSIONALES. UNA NUEVA PERSPECTIVA PARA LA INFERTILIDAD MASCULINA

1. INTRODUCCIÓN

La espermatogénesis es un proceso complicado que consiste en la proliferación y diferenciación de células germinales masculinas. Este proceso comienza en la pubertad y se continúa durante la madurez en los machos de mamíferos.
Este proceso  está controlado por el sistema endocrino y por interacciones entre las células germinales en desarrollo y el microambiente que las rodea a través de factores autocrinos y paracrinos. En este aspecto las interacciones entre las células germinales y las células de Sertoli son críticas.
La mayoría de los estudios realizados durante los años 80 usaban métodos de cultivo convencionales, en los que se usaban placas revestidas o no de plástico en las que las células germinales o somáticas se cultivaban solas o en cocultivo.
Actualmente existen algunos modelos animales experimentales para el análisis de la espermatogénesis, que también son útiles para estudiar los efectos tóxicos en este tipo de células.
Gracias al estudio de la espermatogénesis in situ en estos modelos, hemos comprendido que la distribución espacial de las células testiculares es de vital importancia para la regulación y la capacidad madurativa de los espermatozoides.(1)
En un principio se probaron los cultivos convencionales en dos dimensiones, pero se vio que la composición celular y las señales producidas en ellos difieren mucho de las condiciones in vivo. Debido a esto se quiso  mejorar el proceso in vitro potenciando las interacciones entre las células germinales, las células somáticas y la matriz extracelular, poniendo a prueba los cultivos en tres dimensiones.

2. SISTEMAS DE CULTIVO TRIDIMENSIONALES
El cultivo en tres dimensiones ha causado un gran impacto en el campo de la biología celular. Y en el nuestro en particular, se usan para  imitar el microambiente del epitelio seminífero.
Existen varios tipos de sistemas:

2.1 SACS (Sistema de cultivo en agar blando)
Este sistema fue utilizado inicialmente para el cultivo de células hematopoyéticas y se aprobó también para el cultivo celular testicular.
El sistema SACS está compuesto por dos capas, una sólida y más gruesa en el fondo (0,5% w/v de agar) y otra más fina y ligera (textura de gel o semisólida) en la parte superior (0,37% w/v agar). Si sustituimos el agar por metilcelulosa, obtendríamos el cultivo MCS (sistema de cultivo en metilcelulosa). Esta disposición bifásica permite añadir diferentes fracciones celulares a cada compartimento.
Se separan las espermatogonias indiferenciadas mediante MACS debido a que expresan en su superficie el marcador específico Gfrα1, y así se obtienen fracciones enriquecidas con SSC por selección positiva.
La fracción que  se descarta en el MACS, es  una fracción que contiene todas las células somáticas presentes en la preparación testicular pero exentas de espermatogonias, por lo que se usa esta fracción como fuente de células somáticas testiculares para los experimentos.
La fracción descartada en el MACS se añade a la fase sólida, que contiene sobre todo células de Sertoli. Se añaden las espermatogonias a la capa superior en fase de gel, y se analiza a diferentes tiempos desde el día 1 hasta varias semanas. (Figura 1)

Figura 1(2)
En el estudio de Stukenborg et al. (2) lo que hicieron estudiar el efecto de la adición de células somáticas al cultivo, y el de la adición de gonadotropinas al medio.
Durante las primeras 24 horas de cultivo el número de células descendía, y la apoptosis parecía ser el mecanismo mayoritario por el cual se perdían las células (abundantes células positivas mediante la técnica TUNEL).
Había una mejor supervivencia y diferenciación en aquellas placas en las que se había añadido células somáticas a la capa inferior. Esto se observó  desde las 24 horas hasta el día 16 del cultivo.
Por ello, la presencia de las células somáticas, aunque no el contacto directo es obligatorio para la eficiencia en la proliferación de células germinales in vitro.
Mediante otros experimentos con gonadotrofinas, se vio finalmente que sólo se observaban espermatozoides maduros en aquellos cultivos SACS y MCS con células somáticas en los que se habían administrado gonadotrofinas, lo que indicaba un papel muy importante de las hormonas en el desarrollo de células germinales.
El grupo de Mahmoud et al (3), así como otros grupos (6) también obtuvieron resultados semejantes a los que hemos mencionado, pero además, obtuvieron espermatozoides morfonormales con presencia de acrosoma. Se les provocó la reacción acrosómica con un ionóforo, y respondieron bien,  lo que sugiere que tienen capacidad de fertilizar.
El único inconveniente era la baja eficiencia de los sistemas, ya que el número de espermatozoides normales era muy bajo, aunque su detección no era un hecho aislado.

2.2MATRICES DE COLÁGENO
Lee et al (4) realizaron un estudio con pacientes azoospérmicos no obstructivos para valorar la eficiencia del cultivo tridimensional con matrices de colágeno.
Las suspensiones de células testiculares se mezclaban con una solución rica en colágeno. Esta matriz al solidificar reducía su tamaño en un 75% después de 12 días  en cultivo en un incubador humidificado a 32ºC, y se vio que  aumentaban las interacciones célula a célula y célula- matriz. Además, las células dentro del gel parecían permanecer vivas y homogéneas durante todo el periodo de cultivo.
Después de la evaluación citológica en día 12, se observaron pocos espermatocitos en paquitene pero más espermátides redondas y en elongación. (Figura 2)


Figura 2(4)

La presencia de espermátidas maduras se confirmó más tarde por inmunoreactividad.
En otro estudio realizado por el mismo autor (5), se compararon cultivos en monocapa, cultivos en gel de colágeno (CG) y colágeno con matrigel (CGM)
Se evalúo la viabilidad y se obtuvo un 42,8% en el monocapa, 70,7% en CG y 76,1% en CGM. Por tanto, la viabilidad en los cultivos CG y CGM era significativamente mayor en la monocapa en el día 22 de cultivo, pero no había diferencias significativas entre CG y CGM. Además, se demostró que había mayor número de células haploides en CG y CGM en comparación con el monocapa. (Figura 3)
Figura 3 (5)

También se observó que si se agitaba el cultivo, la viabilidad celular era significativamente mayor que si el cultivo era estático. Esto era debido a que en los cultivos agitados había una mejor disponibilidad del oxígeno del aire y esto llevó a pensar que la difusión de oxígeno podía mejorar el resultado de la espermatogénesis in vitro en un gel de colágeno.
También se vio que las células en CG y CGM presentaban separaciones muy angostas,  lo que sugería que las células testiculares disociadas podían volver a formar uniones entre ellas en estos cultivos. Así, las células de Sertoli podrían tener una relación estrecha con las células germinales. Esto fue demostrado  por la presencia de células ocludina positivas.
Se comprobó finalmente que las células obtenidas eran TP2 y PRM2, que son genes muy expresados en células germinales postmeióticas.  Además , también  se vio que existía un aumento significativo de RNAm de TP2. Esto indicaba que las células germinales masculinas se desarrollaban más allá de la espermátida redonda. (Figura 4)
Figura 4 (5)


3. CONCLUSIONES

Los presentes estudios definen un nuevo sistema tridimensional en un intento de idear un cultivo a largo plazo que pueda ayudar a mejorar la espermatogénesis in vitro de células germinales humanas. Esto se debe a la similitud con el microambiente en el que tiene lugar el proceso, ya que es tridimensional.
Parece ser que la presencia de células somáticas y la estimulación por gonadotrofinas es crucial para la generación de espermatozoides in vitro, sin importar la naturaleza de la matriz. También mejora la viabilidad celular cuando se proporciona agitación, debido a una mejor disponibilidad de oxígeno.
Estos sistemas proporcionan células testiculares con viabilidad, progresión meiótica y diferenciación postmeiótica. Por tanto pueden ser útiles para elucidar los mecanismos que controlan el desarrollo de la línea germinal y para el diseño de terapia dirigida al tratamiento clínico de infertilidad masculina causada por el bloqueo de la espermatogénesis
Uno de los principales inconvenientes que presentan estas técnicas es el bajo número de espermatozoides producidos, aspecto en el cual han de enfocarse los próximos esfuerzos por parte de los investigadores.
A pesar de que los resultados son favorables, prometedores y esperanzadores, la optimización de la eficiencia de estas técnicas sigue siendo un reto en la biología reproductiva.




4. BIBLIOGRAFIA

(1) Sato et al. “Studying Spermatogenesis by using In vivo and In vitro Models:
Advantages and Disadvantages of these Models for Practical Use”, J Veterinar Sci Technolo 2012, 3:1

(2). Jan-Bernd Stukenborg  et al New horizons for in vitro spermatogenesis? An update on novel three-dimensional culture systems as tools for meiotic and post-meiotic differentiation of testicular germ cells Molecular Human Reproduction, Vol.15, No.9 pp. 521–529, 2009

(3) HULEIHEL MAHMOUD “Concise Review: Spermatogenesis in an Artificial Three Dimensional System” STEM CELLS 2012;30:2355–2360


(4) Lee et al. “In vitro differentiation of germ cells from
nonobstructive azoospermic patients using threedimensional
culture in a collagen gel matrix”  Fertility and Sterility_ Vol. 87, No. 4, April 2007

(5)J.H. Lee et al.  “In vitro spermatogenesis by three-dimensional culture of rat testicular cells in collagen gel matrix” Biomaterials 27 (2006) 2845–2853


(6)Mahmoud Abu Elhija et al. “Differentiation of murine male germ cells to spermatozoa in a soft agar culture system “Asian Journal of Andrology (2012) 14, 285–293


 Autores
Mariela Andrade Euvin
Celia Delgado Moro
Cristina Torres Durán


Máster en Biología y Tecnología de la Reproducción. Curso 2013-2014. Universidad de Oviedo. 

EVALUACIÓN DE LA CAPACIDAD REPRODUCTIVA EN EL TORO


1.Introducción
El término ‘’breeding soundness’’ (capacidad reproductiva) se refiere a la habilidad de un toro para preñar vacas.
La eficiencia reproductiva del toro es el factor económico más importante en una ganadería, teniendo más impacto que la tasa de crecimiento, índice de conversión  o condición corporal. Podemos encontrar toros completamente estériles y otros capaces de producir gestación pero con baja eficiencia, que pueden alcanzar una tasa de  20-40% del total.
Los problemas de subfertilidad en machos pueden originar problemas como el aumento del intervalo entre partos, menor peso al nacimiento de las crías o un incremento en el número de vacas desechadas por fallos reproductivos erróneamente achacados a ellas.
Para mejorar los índices reproductivos de una ganadería, aunque en ella encontremos toros de pobre capacidad reproductiva, se puede incrementar el número de machos y así conseguir un mayor ratio macho/hembra.

2.Evaluación tradicional de la capacidad reproductiva
Los dos métodos habituales para evaluar el potencial reproductivo de un toro son: 1) capacidad de conseguir gestación en un gran número de hembras fértiles y evaluar la tasa de preñez  2) evaluar el buen estado reproductivo. Se recomienda llevar a cabo una evaluación de los toros, ya sean propios o comprados, antes de las cubriciones para eliminar los toros con baja fertilidad.  
Los momentos más indicados para realizar un estudio a los machos son: 1) antes de la época de cubrición, 2) antes de una compra, 3) en casos de escaso éxito reproductivo.
Para evaluar la calidad de los toros es esencial el papel de un veterinario.
En el estudio de la capacidad reproductiva se tienen en cuenta factores como un buen estado físico general, manifestación de líbido y calidad del semen. Por tanto, el buen estado reproductivo se basa en una valoración física y en la capacidad del toro para cumplir el umbral mínimo de desarrollo testicular, motilidad espermática y morfología de espermatozoides normales.

2.1 Examen físico
Para comenzar la evaluación de la capacidad reproductiva se hace un examen físico que debe valorar el estado de salud general. Es importante observar al toro en movimiento, para descartar posibles cojeras. Deben tener un tamaño conforme a su edad y adecuada proporción de musculatura y grasa corporal. Los aplomos han de estar libres de defectos que limiten la movilidad o la monta.
Escroto y testículos en terneros destetados y añojos:
La primera selección se hace a los 7-10 meses de edad, siendo el principal criterio a esta edad el desarrollo testicular. La circunferencia escrotal es un parámetro que aporta información sobre el desarrollo testicular. Cualquier toro por debajo de la media de circunferencia escrotal ha de ser desechado.
Tabla 1. Valores de circunferencia escrotal críticos en distintas razas de toro.
Razas de toros
Circunferencia escrotal mínima para alcanzar >30cm a los 365 días de edad
Simmental (doble aptitud), Angus (aptitud cárnica) y derivados de Cebú
> 23cm a los 198-291 días
Charolais (aptitud cárnica), Pored Hereford (aptitud cárnica)
>26cm

           La criptorquidia no es común en el ganado bovino, pero cualquier animal que presente esta alteración será automáticamente descartado.
            Cuando los toros alcanzan el año de edad la diferencia en la calidad de semen entre distintos animales aumentan con la edad (tabla 2).



Tabla 2. Porcentaje de toros de un año (n=254) de varias razas de carne con calidad satisfactoria de semen.1
Edad (meses±15d)
Número toros
Media (rango) SC (cm)
Calidad seminal satisfactoria
(%)
12
40
33.8 (28.5-39.5)
40
13
100
34.5 (28-41)
55
14
84
34.1 (28-45)
56
15
30
34.9 (27-41)
73

Examen escrotal y testicular

Figura 1. Testículos de apariencia normal
Al evaluar el escroto y los testículos, además del diámetro de su circunferencia hay que descartar la presencia de cicatrices u otras patologías que les afecten. Los testículos han de poder moverse dentro del escroto libremente, con una diferencia de tamaño entre ambos menor al 10%. Se palpan para comprobar su textura y descartar presencia de calcificaciones, granulomas, etc.  Los testículos blandos van a indicar la presencia de degeneración, por el contrario, la firmeza excesiva es indicativa de daño testicular irreversible. También hay que palpar el epidídimo para detectar la posible presencia de granulomas y el cordón espermático para ver si hay varicocele.   

        
 El diámetro escrotal mínimo que se exige depende de la edad, aumentando conforme ésta avanza (tabla 3).

 Tabla 3. Diámetro mínimo de circunferencia escrotal (SC) según la edad.5

Edad (meses)
Mínimo SC (cm)
≤15
30
15-18
31
18-21
32
21-24
33
>24
34

Se sabe que la circunferencia escrotal está altamente relacionada con el peso de los testículos, la producción de esperma diaria y la calidad seminal.
Además la circunferencia escrotal sirve para predecir aparición de la pubertad, mejor incluso que otros parámetros como la edad o el peso.
Examen de órganos reproductivos internos
Se realiza un examen transrectal para comprobar posición y tamaño de la próstata, vesículas seminales y ampollas.
Figura 2. Aparato genital de toro


La anomalía más común en el examen transrectal es la excesiva firmeza o pérdida de lobulación en la superficie de las glándulas vesiculares (vesículas seminales). Pueden verse afectadas las dos, pero lo más común es que el problema se presente de forma unilateral.
Para descartar la presencia de infecciones se pueden realizar frotis de semen en los que se aprecien ausencia de neutrófilos.



Examen del pene y prepucio
Hay que examinar el pelo del extremo del prepucio para ver si hay presencia de sangre o exudados que puedan indicar daño peneano o prepucial. La presencia de partículas pequeñas a este nivel puede indicar urolitiasis. Por palpación se comprueba la existencia de áreas de inflamación o fibrosis. Esta evaluación se realiza normalmente durante la recolección de semen.

3. Extracción de la muestra
Electroeyaculación
El método más común para la recolección de semen en toro es la electroeyaculación. Está técnica se lleva a cabo mediante máquinas que estimulan eléctricamente los genitales internos a través de una sonda rectal. La estimulación comienza con una pequeña tensión de una duración de 2-3 segundos, seguido de un periodo de descanso de tres segundos. El manipulador puede controlar la magnitud y la frecuencia de los mismos. Hay diferencias aparentes entre razas en la facilidad de eyacular mediante esta técnica. Los electrodos se colocan en posición ventral, para estimular las vesículas seminales, próstata y ampollas para inducir la eyaculación. Las ventajas de estos electrodos son que la corriente de estimulación va dirigida hacia los tejidos diana, con mínima estimulación no deseada de otra zona pélvica, musculatura o nervios. Sin embargo, requiere la presencia de un técnico experto. Aunque existe una amplia variación entre los toros, la mayoría de ellos comienzan a lograr la congestión del pene después de 8 a 15 estímulos eléctricos, seguidos de la extensión y la erección. A medida que aumenta la estimulación comienza a eyacular la fracción pre-espermática, seguida de 4 a 8 pulsos de fracción rica en esperma.
Figura 3. Electroeyaculador tipo  “electroyac 6”.

A pesar de que la electroeyaculación es un método fiable y conveniente en la extracción de semen existe controversia sobre su uso, ya que podría conllevar efectos negativos en el animal.
 
Para la mayoría de toros la recolección de semen por electroeyaculación no causa mucho dolor. Sin embargo, con descargas eléctricas de elevada intensidad, algunos toros, especialmente los añojos, vocalizan o se resisten. En varios países europeos está prohibido por bienestar animal. La Unión Europea prohibió desde 1991 hasta 1995 la recogida de semen mediante este método.
Hoy en día se utilizan métodos para reducir el estrés como el uso de anestesia, y se realizan estudios para reducir el estrés generado por esta práctica aunque es difícil evaluar el dolor o sufrimiento del animal.
La técnica puede estar influida por los fármacos utilizados (tranquilizantes) así como una incorrecta manipulación del operario.





Métodos alternativos
Las ampollas son terminaciones dilatadas del conducto deferente y sirven como reservorio para el eyaculado. La estimulación de las mismas mediante masaje pueden inducir la eyaculación. Las desventajas de este método son el requerimiento de personal cualificado, contaminación, la calidad de la muestra obtenida no es tan buena y el cuidado por parte del operario para evitar irritación rectal. Además este método a veces falla, no consiguiéndose eyaculación.
Otro método alternativo en la recolección del semen es la vagina artificial, muy utilizado en centros de inseminación pero no en el campo.

4 .Parámetros a evaluar
Volumen y concentración del eyaculado
            El volumen y la concentración espermática obtenidos de semen recogido mediante electroeyaculación no son representativos, estos valores sí se pueden tener en cuenta cuando la muestra es recogida mediante vagina artificial, ya que se trata de un método más parecido al fisiológico. 
Tabla 4. Términos frecuentemente utilizados para describir la concentración espermática. (Concentraciones de 106 sperm/ml)


Motilidad espermática
La motilidad se ve reducida por temperaturas extremas, contaminación por orina, jabón u otras sustancias, por lo que es importante proteger al semen de estos factores.
La evaluación de la motilidad se puede realizar colocando una gota de semen sobre un porta. Con pocos aumentos se aprecia la motilidad en masa, y a mayores aumentos se consigue ver la motilidad progresiva. El umbral para considerar un buen  potencial de capacidad reproductiva es un 30% de motilidad progresiva.
Morfología espermática
La morfología de los espermatozoides debe ser evaluada con aceite de inmersión con el fin de examinarlos individualmente. Hay que preparar un portaobjetos mezclando el esperma diluido con tinción de eosina - nigrosina para la evaluación con un microscopio de campo claro. Se debe contar un mínimo de 100 espermatozoides, si se observan anomalías la evaluación de 300 espermatozoides proporcionará un recuento más preciso .
Los defectos morfológicos en el esperma pueden considerarse como compensables o no compensable. En caso de anomalías compensables se pueden superar mediante un aumento de dosis. La presencia de vacuolas nucleares es considerado como un defecto no compensable.
Se ha relacionado la presencia de más de un 30% de espermatozoides morfológicamente anormales y más de un 20% con defectos en la cabeza con una disminución de la fertilidad.
La fertilización está disminuida en toros que presentan un 30% o más de espermatozoides con gota citoplasmática proximal. La presencia de esta anomalía suele estar asociada con inmadurez o degeneración testicular. En animales añojos que presenten buen aspecto físico y cumplan el resto de requerimientos mínimos, la presencia de gota citoplasmática proximal en unos valores inferiores al 70% de espermatozoides hará que estos toros no se descarten como futuros reproductores.
Ultrasonografía para evaluar tejidos reproductivos
El uso clínico de la ultrasonografía para la evaluación de la función reproductiva en el toro es la caracterización de las lesiones detectables en testículos y escroto. Las ondas ultrasonográficas no afectan a la calidad del semen ni a la producción espermática. Esta metodología puede utilizarse para detectar y categorizar patologías del testículo y glándulas accesorias.
Termografía de infrarrojos para evaluación de testículos y escroto
Una espermatogénesis normal requiere una temperatura de 4 ºC a 5 ºC por debajo a la corporal (38 ºC). Es un método no invasivo para evaluar la temperatura de la superficie escrotal. Esta técnica tiene potencial para examinar la capacidad fertilizante del toro, aunque su uso es restringido por su alto coste económico.

5.Clasificación de la capacidad reproductiva
1.Reproductores potencialmente satisfactorios: producen al menos un 70% de espermatozoides morfológicamente normales, con al menos  30% motilidad progresiva. Libres de defectos oculares y musculoesqueléticos.
2.Reproductores no satisfactorios: a) aquellos que sufren algún defecto que puede revertirse han de ser re-evaluados con posterioridad,  b) reproductores potencialmente no satisfactorios,  aquellos que sufren daños congénitos u otros caracteres que comprometen su fertilidad y no son reversibles. Tienen defectos indeseables e irreversibles, y se descartan como sementales.
¿Qué parámetros se evalúan en el laboratorio?
1. Motilidad de los espermatozoides utilizando la técnica CASA (Computer Assisted Sperm Analysis). Técnica mucho más objetiva que la evaluación visual. Con la metodología CASA se pueden evaluar aspectos que se correlacionan con la fertilidad del toro (velocidad, motilidad total, lineal, etc.).
2. Viabilidad espermática (integridad de membrana). Para que haya fertilización es esencial que la membrana plasmática del espermatozoide sea funcional. Existen diferentes métodos de evaluación como son:  tinción eosina-nigrosina, azul de tripano, sondas fluorescentes como SYBR-14 y ioduro de propidio y HOST (Hypo-osmotic Swelling Test). Brito et al. compararon estos métodos de evaluación de membrana espermática y observaron que el método HOST es el único que contribuye a predecir el éxito en fertilización in vitro tras los test convencionales.
3. Descondensación del ADN. La integridad de la cromatina espermática es crítica para la fertilización y el desarrollo embrionario posterior. El estrés oxidativo se sugirió como una causa importante de daño en el ADN de esperma, reduciendo la preimplantación, el desarrollo del embrión y las tasas de preñez. Además, el aumento de la temperatura testicular reduce la estabilidad de ADN espermático  y la capacidad de estos espermatozoides a someterse a la descondensación de ADN y la formación de pronúcleos. La técnica “Sperm Chormatin Structure Assay” (SCSA) utiliza la citometría de flujo para determinar la integridad de la cromatina, basado en la resistencia a la desnaturalización con ácido.
4. Proteínas. Proteínas de unión a heparina se proponen como medio para predecir diferencias de fertilidad entre toros que producen un esperma morfológicamente normal. Existe relación entre proteínas específicas del plasma seminal y fertilidad. Las proteínas espermáticas difieren entre toros de alta y baja capacidad reproductiva.
5. Anomalías morfológicas en el espermatozoide.  Se ha demostrado que espermatozoides morfológicamente anormales fracasaron durante la interacción de gametos o en desarrollo preimplantacional. Además, los embriones resultantes de la fecundación de los ovocitos por espermatozoides morfológicamente normales, coexistiendo en el eyaculado  junto con los espermatozoides anormales, mostraron menor competencia de desarrollo, lo que sugiere que estos espermatozoides fueron perjudicados funcionalmente .

Figura 4. Evaluación de la viabilidad de los espermatozoides. Los espermatozoides viables quedan teñidos de verde (SYBR-14) y los muertos de rojo (ioduro de propidio) parcial o completamente. Foto: Dr. Felipe Martínez Pastor.

Daños en el ADN del esperma debido al estrés oxidativo, anomalías cromosómicas y los efectos ambientales, incluyendo elevada temperatura testicular, el tiempo de inseminación artificial en relación al estro , la duración del almacenamiento de esperma, el tiempo de la interacción espermatozoide-ovocito, la edad de los machos y los agentes infecciosos en el semen influyen en la calidad del embrión (revisado por Chenoweth , 2007 ).
Conclusión
El examen normal de capacidad reproductiva identifica toros que son claramente deficientes, pero no aquellos con fallos mínimos o subfértiles. El reto del análisis seminal es identificar correctamente a este grupo de toros subfértiles. 
Las variaciones de fertilidad entre los toros clasificados como satisfactorios sugieren que pueden existir diferencias submicroscópicas en el esperma de los toros. Por lo tanto, entender las bases moleculares de estas diferencias en las características del esperma,  puede permitirnos desarrollar ensayos para complementar la evaluación tradicional del buen estado reproductor y mejorar la  predicción de fertilidad de los toros.

Bibliografía
1. John P. Kastelic, Jacob C. Thundathil, Leonardo F. C. Britoc: Bull BSE and semen analysis for predicting bull fertility. Proceedings of the Society for Theriogenology 2012 Annual Conference.
2. Thundathil J., Meyer R., Palasz A.T., et al: Effect of the knobbed acrosome defect in bovine sperm on IVF and embryo production. Theriogenology 2000;54:921-934.
3. Chenoweth P.J., Osborne H.G.: Breed differences in the response of young bulls to electroejaculation. Vet J 1978;54:333-337.
4. Barth A.D., Oko R.J.: Abnormal morphology of bovine spermatozoa. Ames: Iowa State University; 1989
5. Chenoweth, P.J., Spitzer J.S., Hopkins F.M.: A new bull breeding soundness evaluation rorm. Proc Annu Meet Soc Therio 1992. p. 63-70.
6. Palmer C.W., Brito L.F., Arteaga A.A., et al: Comparison of electroejaculation and transrectal massage for semen collection in range and yearling feedlot beef bulls. Anim Reprod Sci 2005;87:25-31

7. Amelia J.Falk. Effects of epidural lidocaine anesthesia on bulls during electroejaculation Can Vet J volume 42, February 2001 

Autores
María Barros San Cristóbal
José Daniel Jiménez Calderón
Alicia Román Trufero