1. INTRODUCCIÓN
La
espermatogénesis es un proceso complicado que consiste en la proliferación y
diferenciación de células germinales masculinas. Este proceso comienza en la
pubertad y se continúa durante la madurez en los machos de mamíferos.
Este
proceso está controlado por el sistema
endocrino y por interacciones entre las células germinales en desarrollo y el
microambiente que las rodea a través de factores autocrinos y paracrinos. En
este aspecto las interacciones entre las células germinales y las células de
Sertoli son críticas.
La
mayoría de los estudios realizados durante los años 80 usaban métodos de
cultivo convencionales, en los que se usaban placas revestidas o no de plástico
en las que las células germinales o somáticas se cultivaban solas o en
cocultivo.
Actualmente
existen algunos modelos animales experimentales para el análisis de la
espermatogénesis, que también son útiles para estudiar los efectos tóxicos en
este tipo de células.
Gracias
al estudio de la espermatogénesis in situ en estos modelos, hemos comprendido
que la distribución espacial de las células testiculares es de vital
importancia para la regulación y la capacidad madurativa de los
espermatozoides.(1)
En
un principio se probaron los cultivos convencionales en dos dimensiones, pero
se vio que la composición celular y las señales producidas en ellos difieren
mucho de las condiciones in vivo. Debido a esto se quiso mejorar el proceso in vitro potenciando las
interacciones entre las células germinales, las células somáticas y la matriz
extracelular, poniendo a prueba los cultivos en tres dimensiones.
2. SISTEMAS DE CULTIVO TRIDIMENSIONALES
El
cultivo en tres dimensiones ha causado un gran impacto en el campo de la
biología celular. Y en el nuestro en particular, se usan para imitar el microambiente del epitelio
seminífero.
Existen
varios tipos de sistemas:
2.1 SACS (Sistema de cultivo en agar
blando)
Este
sistema fue utilizado inicialmente para el cultivo de células hematopoyéticas y
se aprobó también para el cultivo celular testicular.
El
sistema SACS está compuesto por dos capas, una sólida y más gruesa en el fondo
(0,5% w/v de agar) y otra más fina y ligera (textura de gel o semisólida) en la parte
superior (0,37% w/v agar). Si sustituimos el agar por metilcelulosa,
obtendríamos el cultivo MCS (sistema de cultivo en metilcelulosa). Esta
disposición bifásica permite añadir diferentes fracciones celulares a cada
compartimento.
Se
separan las espermatogonias indiferenciadas mediante MACS debido a que expresan
en su superficie el marcador específico Gfrα1, y así se obtienen fracciones
enriquecidas con SSC por selección positiva.
La
fracción que se descarta en el MACS, es una fracción que contiene todas las células
somáticas presentes en la preparación testicular pero exentas de
espermatogonias, por lo que se usa esta fracción como fuente de células
somáticas testiculares para los experimentos.
La
fracción descartada en el MACS se añade a la fase sólida, que contiene sobre
todo células de Sertoli. Se añaden las espermatogonias a la capa superior en
fase de gel, y se analiza a diferentes tiempos desde el día 1 hasta varias
semanas. (Figura 1)
Figura 1(2)
En
el estudio de Stukenborg et al. (2) lo que hicieron estudiar el efecto de la
adición de células somáticas al cultivo, y el de la adición de gonadotropinas
al medio.
Durante
las primeras 24 horas de cultivo el número de células descendía, y la apoptosis
parecía ser el mecanismo mayoritario por el cual se perdían las células (abundantes
células positivas mediante la técnica TUNEL).
Había
una mejor supervivencia y diferenciación en aquellas placas en las que se había
añadido células somáticas a la capa inferior. Esto se observó desde las 24 horas hasta el día 16 del
cultivo.
Por
ello, la presencia de las células somáticas, aunque no el contacto directo es
obligatorio para la eficiencia en la proliferación de células germinales in
vitro.
Mediante
otros experimentos con gonadotrofinas, se vio finalmente que sólo se observaban
espermatozoides maduros en aquellos cultivos SACS y MCS con células somáticas
en los que se habían administrado gonadotrofinas, lo que indicaba un papel muy
importante de las hormonas en el desarrollo de células germinales.
El
grupo de Mahmoud et al (3), así como otros grupos (6) también obtuvieron
resultados semejantes a los que hemos mencionado, pero además, obtuvieron
espermatozoides morfonormales con presencia de acrosoma. Se les provocó la
reacción acrosómica con un ionóforo, y respondieron bien, lo que sugiere que tienen capacidad de fertilizar.
El
único inconveniente era la baja eficiencia de los sistemas, ya que el número de
espermatozoides normales era muy bajo, aunque su detección no era un hecho aislado.
2.2MATRICES DE COLÁGENO
Lee
et al (4) realizaron un estudio con pacientes azoospérmicos no obstructivos
para valorar la eficiencia del cultivo tridimensional con matrices de colágeno.
Las
suspensiones de células testiculares se mezclaban con
una solución rica en colágeno. Esta matriz al solidificar reducía su tamaño en un 75% después de 12 días en cultivo en un incubador humidificado a
32ºC, y se vio que aumentaban las interacciones célula a célula y
célula- matriz. Además, las células dentro del gel parecían permanecer vivas y
homogéneas durante todo el periodo de cultivo.
Después
de la evaluación citológica en día 12, se observaron pocos espermatocitos en
paquitene pero más espermátides redondas y en elongación. (Figura 2)
Figura 2(4)
La
presencia de espermátidas maduras se confirmó más tarde por inmunoreactividad.
En
otro estudio realizado por el mismo autor (5), se compararon cultivos en
monocapa, cultivos en gel de colágeno (CG) y colágeno con matrigel (CGM)
Se
evalúo la viabilidad y se obtuvo un 42,8% en el monocapa, 70,7% en CG y 76,1% en CGM. Por tanto, la viabilidad en los cultivos CG y CGM era
significativamente mayor en la monocapa en el día 22 de cultivo, pero no había
diferencias significativas entre CG y CGM. Además, se demostró que había mayor
número de células haploides en CG y CGM en comparación con el monocapa. (Figura 3)
Figura 3 (5)
También
se observó que si se agitaba el cultivo, la viabilidad celular era
significativamente mayor que si el cultivo era estático. Esto era debido a que en los cultivos agitados había una mejor disponibilidad del oxígeno del aire y
esto llevó a pensar que la difusión de oxígeno podía mejorar el resultado de la espermatogénesis in
vitro en un gel de colágeno.
También
se vio que las células en CG y CGM presentaban separaciones muy angostas, lo que sugería que las células testiculares
disociadas podían volver a formar uniones entre ellas en estos cultivos. Así,
las células de Sertoli podrían tener una relación estrecha con las células
germinales. Esto fue demostrado por la
presencia de células ocludina positivas.
Se comprobó finalmente que
las células obtenidas eran TP2 y PRM2, que son genes muy expresados en células
germinales postmeióticas. Además ,
también se vio que existía un aumento
significativo de RNAm de TP2. Esto indicaba que las células germinales
masculinas se desarrollaban más allá de la espermátida redonda. (Figura 4)
Figura
4
(5)
3. CONCLUSIONES
Los presentes estudios definen un nuevo sistema tridimensional en un intento de idear un cultivo a largo plazo que pueda ayudar a mejorar la
espermatogénesis in vitro de células germinales humanas. Esto se debe a la
similitud con el microambiente en el que tiene lugar el proceso, ya que es
tridimensional.
Parece ser que la presencia de células somáticas y
la estimulación por gonadotrofinas es crucial para la generación de
espermatozoides in vitro, sin importar la naturaleza de la matriz. También
mejora la viabilidad celular cuando se proporciona agitación, debido a una
mejor disponibilidad de oxígeno.
Estos sistemas proporcionan células testiculares con
viabilidad, progresión meiótica y diferenciación postmeiótica. Por tanto pueden
ser útiles para elucidar los mecanismos que controlan el desarrollo de la línea
germinal y para el diseño de terapia dirigida al tratamiento clínico de
infertilidad masculina causada por el bloqueo de la espermatogénesis
Uno de los principales inconvenientes que presentan
estas técnicas es el bajo número de espermatozoides producidos, aspecto en el
cual han de enfocarse los próximos esfuerzos por parte de los investigadores.
A
pesar de que los resultados son favorables, prometedores y esperanzadores, la
optimización de la eficiencia de estas técnicas sigue siendo un reto en la
biología reproductiva.
4. BIBLIOGRAFIA
(1) Sato et al. “Studying
Spermatogenesis by using In vivo and In vitro Models:
Advantages
and Disadvantages of these Models for Practical Use”, J Veterinar Sci Technolo 2012, 3:1
(2). Jan-Bernd Stukenborg et al “New horizons for in
vitro spermatogenesis? An update on novel three-dimensional
culture systems as tools for meiotic and post-meiotic differentiation
of testicular germ cells” Molecular
Human Reproduction, Vol.15, No.9 pp. 521–529, 2009
(3) HULEIHEL MAHMOUD “Concise Review: Spermatogenesis in an Artificial Three Dimensional
System” STEM CELLS 2012;30:2355–2360
(4) Lee et al. “In
vitro differentiation of germ cells from
nonobstructive
azoospermic patients using threedimensional
culture
in a collagen gel matrix” Fertility and Sterility_ Vol. 87, No. 4,
April 2007
(5)J.H. Lee et al. “In vitro spermatogenesis by
three-dimensional culture of rat testicular cells in collagen gel matrix” Biomaterials
27 (2006) 2845–2853
(6)Mahmoud
Abu Elhija et al. “Differentiation of murine male germ cells to
spermatozoa in a soft agar culture system “Asian Journal of Andrology (2012) 14, 285–293
Autores
Mariela Andrade Euvin
Celia Delgado Moro
Cristina Torres Durán
Máster en Biología y Tecnología de la Reproducción. Curso 2013-2014. Universidad de Oviedo.
Está muy bien, una buena revisión y citáis varios trabajos, incluyendo algo de material mientras hacéis referencia a ellos. Hay solo algunas cuestiones que no me quedan claras, o que tal vez deberíais revisar.
ResponderEliminarEn SACS habláis de fase sólida vs. fase de gel. Parece que ambas son geles y sólidas, ya que solo se diferencian en la % de agar. ¿Estoy en lo correcto? ¿Se usa esta terminología en los trabajos originales? Tal vez sea sólida y semisólida (no estoy muy enterado de estos temas de cultivos).
En cuanto al lenguaje, solo he visto algún problema con el tiempo verbal (en presente al describir algún estudio previo), y si podéis revisad las unidades (hay algún % que se ha escapado y algún espacio de más o de menos. En lo posible, evitad las abreviaturas, aunque sea un trabajo científico. Las que he visto se utilizan solo 2 o 3 veces, creo que no os hacen falta.
Al final del punto 2.2 habláis de dos marcadores, TP2 y PRM2. Deberíais especificar si lo que detectaron los autores fue un incremento de expresión, más mRNA, o más proteína. En ese punto no se entiende muy bien qué queréis decir con que "las células en CG y CGM estaban conectadas con un pequeño espacio entre ellas". Si tenían un espacio entre ellas, ¿cómo ocurría la interacción?
Me gustan las conclusiones, muy claras.
Ya están corregidos los tiempos verbales y las unidades, así como las abreviaturas. Hemos considerado abreviaturas las de "3D", ya que cuando hablamos de MACS, SACS y MCS, lo citan así en los diferentes artículos.
ResponderEliminarEn lo relativo al punto 2.2, lo de la conexión entre las células en CG y CGM lo hemos vuelto a redactar de forma que creemos no quede ambigua, como quedaba antes. Sobre los marcadores TP2 y PRM2, lo volvimos a mirar, y lo redactamos de nuevo con la información que nos pedías. Es cierto que debíamos haberlo explicado mejor.
En cuanto a tu pregunta sobre las fases del cultivo SACS, hay artículos en los que a la fase superior la llama "soft" y otros en los que se refieren a ella como fase gel. Como no encontrábamos una traducción adecuada al castellano de "soft" que encajase bien en la descripción, decidimos utilizar la palabra gel, que también es usada, y que nos pareció que se adecuaba más para la descripción.
Creo que con todo esto, ya están solucionados los problemas que nos planteaste. De todas formas si hubiera algo más, háznoslo saber para poder cambiarlo.
Sí, en el caso de MACS, etc., son abreviaturas que se han convertido en acrónimos, es decir, que se usan como palabras.
ResponderEliminarSobre el SACS, creo que esa terminología se usa en la preparación de geles. Si se añade más matriz (agar o lo que sea), queda más consistente, pero siempre se trata de gel. Podéis usar la terminología que usen en el artículo, si pensáis que podría usarse como estándar.
Creo que ha quedado bastante bien.
Finalmente, hemos decidido poner "textura de gel o semisólida", para aclararlo mejor, y así usar la terminología del artículo junto con la característica de esa fase. Así quizá se consiga comprender mejor.
ResponderEliminarMuy bien.
ResponderEliminar