CONSERVACIÓN DE DELFINES: NUEVAS ESTRATEGIAS PARA UN MEJOR USO DEL SEMEN SEXADO Y LAS TÉCNICAS DE REPRODUCCIÓN ASISTIDA

La predeterminación del sexo es un medio atractivo para controlar la proporción de sexos en una población determinada de animales de producción o de la fauna salvaje. El sexado de espermatozoides de mamíferos mediante citometría de flujo para su uso en inseminación artificial (IA) o fecundación in vitro (IVF) ha dado lugar al nacimiento de cientos de miles de descendientes en numerosas especies y sigue siendo el único método científicamente probado para la selección del sexo en el momento de la concepción. El sexado del semen se puede realizar debido a la diferencia en el contenido de ADN total entre los espermatozoides que llevan el cromosoma X (de mayor tamaño) y los que llevan el cromosoma Y (más pequeño). Para lograr la selección, los espermatozoides se tiñen con un colorante que permite que el citómetro de flujo detecte la diferencia de ADN y separarlos en dos poblaciones distintas. En casos como el del toro, el esperma con el sexo seleccionado suele ser criopreservado para su posterior utilización en IA. En referencia a las vacas lecheras, donde interesa sexar el esperma con el fin de obtener un mayor número de hembras (productoras de leche), existen discrepancias entre: las ventajas de la determinación del sexo, el método por el cual los espermatozoides son sexados y los efectos del proceso de clasificación en la viabilidad de los espermatozoides y la fertilidad. Se discuten además las distintas vías por las cuales semen sexado puede ser difundido, así como el estado del esperma después de someterlo a técnicas de criopreservación.

El uso de espermatozoides seleccionados en función del sexo representa una importante ayuda para la recuperación de pequeñas poblaciones de animales, sesgando la población hacia hembras para poder producir más individuos de la especie. Además, en poblaciones en las cuales la proporción de uno de los sexos pueda dejar en desventaja al otro, este problema puede verse solucionado mediante esta técnica de selección. A pesar de estas ventajas de estabilidad reproductiva y social de los programas de IA utilizando espermatozoides sexados y la eficacia demostrada de estas tecnologías en el delfín mular (Tursiops truncatus) comprobadas en múltiples acuarios, la falta de experiencia y los gastos asociados con el proceso de clasificación han frenado su uso. Sería interesante que se ofrecieran más oportunidades en zoológicos para poder mejorar la técnica y ampliar conocimientos. Por otro lado, la disminución en los costes de producción se basa en la disminución de la dosis mínima efectiva para la inseminación. Actualmente, en el caso del delfín mular, se recomienda usar 200 millones de espermatozoides con motilidad progresiva. En otras especies ya se había logrado disminuir la dosis de IA utilizando otro tipo de técnicas de inseminación intrauterinas. Estos métodos se basan en el uso de un endoscopio o un catéter diseñado para depositar el semen cerca o en la misma unión Útero-tubárica (UTJ), en lugar de hacerlo en el cuerno uterino caudal como en la IA convencional.

El sexado por citometría de flujo es un proceso de separación basado en la diferencia en la cantidad de ADN entre los cromosomas X e Y [4]. La diferencia en el contenido de ADN entre los espermatozoides bovinos que llevan el cromosoma X es 3,8% más con respecto al cromosoma Y [3]. En humanos esta diferencia es de un 2,8% y en la mayoría de los mamíferos están en el rango de 3-4,5 % aproximadamente [13]. El cromosoma X es mayor que el Y debido a una mayor cantidad de cromatina heteróloga.

El proceso consiste en el paso de espermatozoides a través de un detector como el citómetro de flujo el cual mide la intensidad de fluorescencia resultado de la excitación de las moléculas de colorante ligado al ADN. Usualmente es generado por un láser y la intensidad de fluorescencia obviamente depende del número de moléculas fluorescentes unidas al DNA [9].

FIGURA 1. ESQUEMA BÁSICO DEL FUNCIONAMIENTO DE UN CITÓMETRO DE FLUJO

 

La intensidad de la luz UV afecta al ADN de los espermatozoides, específicamente a la motilidad de los espermatozoides. En un estudio se uso el colorante Hoeschst 33242. Éste colorea el ADN de manera eficiente y causa menor daño tanto a la morfología como a la motilidad del espermatozoide ya que reduce la intensidad a la que actúa el láser [11].

Un factor negativo de la técnica es la cantidad de espermatozoides que se ven dañados durante el proceso, que fluctúa en torno al 70% de los espermatozoides, que fallan al ser clasificados debido al daño o por la ausencia de distinción al pasar por el citómetro [7]. Además, el campo electrostático, al que se ven sometidos, les produce varios daños como pueden ser: la creación de poros en la membrana, disminuyendo así su capacidad de fecundación,una mayor formación de especies reactivas de oxigeno (ROS), dañando aún más sus membranas, y defectos en la cola, afectando a su motilidad.

Una de las mayores limitaciones de la citometría de flujo es la tasa de clasificación, lo que significa que animales inseminados con semen sexado tienden a recibir menor concentración de espermatozoides por dosis que los animales que experimentan una IA con semen entero. El número de espermatozoides utilizado en la práctica habitual es de 20 x 10⁶ espermatozoides por dosis.

FIGURA 2. EJEMPLAR TURSIOPS TRUNCATUS

En este artículo nos vamos a centrar en el estado actual de la tecnología de separación del semen en la naturaleza, haciendo hincapié a las implicaciones en la gestión y conservación de las especies, centrándonos sobre todo en el delfín mular (Tursiops truncatus).

Exceptuando el volumen de la cabeza del espermatozoide, la única diferencia entre poblaciones de espermatozoides que pueda ser medible y científicamente válida es el contenido de ADN. Como ya hemos mencionado, el cromosoma X de los mamíferos tiene más ADN que el cromosoma Y, siendo esta diferencia la base para la separación de los espermatozoides por citometría de flujo. La técnica analiza cuantitativamente el contenido de ADN y proporciona un método fiable para la identificación y separación de las poblaciones de espermatozoides X e Y. La pureza de más del 90% del sexo deseado se puede lograr utilizando la tecnología de clasificación de esperma actual. El desarrollo de los citómetros de flujo de alta velocidad (MoFlo ^® SX, Dako, Fort Collins, CO, USA) y la mejora de los sistemas de orientación celular ha dado lugar a grandes aumentos en la eficiencia de la clasificación y calidad del esperma.

El uso de la citometría de flujo para sexar espermatozoides frescos y obtener descendencia del sexo determinado se realizó por primera vez en conejos por el equipo de LA. Johnson en 1989. Desde entonces la técnica ha avanzado mucho y se han obtenido descendiente utilizando semen sexado en fresco o congelado, asociándolo a las técnicas de reproducción asistida (TRA) en humanos y en animales(tanto domésticos como es especies salvajes en peligro de extinción). En la especie que nos interesa, el primer delfín mular nació en el año 2005 a cargo del equipo de J.K. O’Brien y T.R Robeck. Ellos llevaron a cabo una investigación para desarrollar la clasificación del semen y metodologías de conservación novedosas para la predeterminación del sexo en el delfín  mular, utilizando la IA. Realizaron varios estudios en los que comprobaron: el efecto que tiene el plasma seminal, la concentración de espermatozoides y la velocidad de congelación en la calidad de los espermatozoides in vitro.

Durante más de treinta años se han estado buscando herramientas para garantizar la sostenibilidad a largo plazo de la población ex situ de delfines mulares. Las TRA son un componente clave de este grupo de herramientas de gestión e incluyen la congelación de semen, inseminación artificial (IA) y la preselección del sexo mediante citometría de flujo.

Se llevó a cabo un estudio para tratar de probar este sistema en la especie de delfines Tursiops truncatus.  Los objetivos de la investigación eran:

·          Desarrollar y describir los métodos de para realizar la IA (profundidad de deposición del semen, el sexado, las dosis).

·          Comparar la calidad espermática diferenciando el semen sexado y el no sexado.

·          Examinar las tasa de embarazo y los partos obtenidos mediante la realización de IA por medio de tres grupos (semen no sexado, semen sexado en pequeña dosis, semen sexado usando la dosis estándar).

En el estudio utilizaron una muestra de 39 hembras obtenidas de diferentes centros zoológicos del mundo que tenían edades mayores de 6 años y pesaban menos de 180 kg. Por otro lado, el tamaño muestral de macho fue de 12, también recogidos de distintas zonas del mundo, y las edades estaban comprendidas entre los 10 y 35 años, con pesos menores a 200 kg. Se alojaron a los individuos en unas piscinas especiales y fueron alimentados de acuerdo a su peso corporal.

Se realizó un seguimiento endocrino recogiendo las muestras de orina. Se siguieron: el estudio de LH (mediante inmunoensayo EIA por análisis retrospectivos), creatinina, conjugados de estrógenos urinarios (mediante ensayo enzimático), y progesterona.
Se intentó además sincronizar el día de la ovulación para programar la IA de la manera más adecuada. Mediante ecografía se vio en detalle la actividad folicular y después se usó para confirmar el embarazo.Los varones fueron capacitados para la eyaculación. Se analizó: la concentración, volumen, motilidad espermática y la integridad de la membrana plasmática utilizando técnicas estandarizadas [6]. Las suspensiones de esperma de cada macho se diluyeron a 200-400 x 10⁶ espermatozoides/ml con medio HEPES-TALP, añadiendo antibiótico (sulfato de estreptomicina) y sometiéndolo a incubación.  Mediante citometría de flujo de alta velocidad fueron obteniendo la separación de los espermatozoides portadores de cromosoma X y portadores de cromosoma Y. Posteriormente se criopreservaron y descongelaron para su uso. Por otro lado, el semen no sexado también fue criopreservado y posteriormente descongelado utilizando bolitas o pajuelas de 0,5ml.

Para la inseminación artificial se tuvo que tratar con diazepan a las hembras para tranquilizarlas. La inseminación fue el paso más complicado del proceso, ya que se encontraron con muchas barreras anatómicas como el pliegue espermatecal (pseudocérvix),  el orificio cervical externo, el orificio cervical interno, la bifurcación uterina y la UTJ.

Las deposiciones del semen que se realizaron fueron:

·          Semen no sexado (gran dosis) depositado en el cuerno uterino, en 9 de las hembras.

·          Semen sexado (dosis estándar) depositado a la mitad del camino dentro de uno o ambos cuernos uterino, en 20 hembras.

·          Semen sexado (pequeña dosis)  concentrado por centrifugación después de su descongelación y depositado en UTJ, en 20 hembras.

Se diagnosticó un embarazo a los 28 días post-IA determinando la concentración de progesterona (superior a 5 ng /ml). Después, se realizaron ecografías para la confirmación y seguimiento de la preñez.

FIGURA 3. BARRERAS ANATÓMICAS VAGINALES
 ENCONTRADASAL REALIZAR LA INSEMINACIÓN [1]

Se encontraron con muchas barreras anatómicas importantes  durante los procedimientos de inseminación que incluyen el pliegue espermatecal (pseudocervix), orificio cervical externo, orificio cervical interno, bifurcación uterina y la UTJ. El paso a través del orificio cervical representó la parte más complicada del procedimiento. 

TABLA 1. EDAD, CARACTERÍSTICAS DEL CICLO ESTRAL Y PARÁMETROS REPRODUCTIVOS
DEL DELFÍN NARIZ DE BOTELLA (TURSIOPS TRUNCATUS) [1]

Entre los resultados que se encontraron se vieron diferencias significativas en la profundidad de la inseminación, en la concentración de espermatozoides utilizada y en el volumen total de la suspensión en los tres grupos.Por el contrario, no se vieron diferencias en cuanto a la tasa de clasificación del esperma, la pureza ni respecto a los métodos de criopreservación. Las tasas de embarazo fueron más o menos parecidas entre los distintos tratamientos, y en todos los tratamientos la tasa de edad afectó a los resultados.

Este estudio sirvió para examinar los factores que afectan a la fertilización en el delfín  mular con espermatozoides sexado y no sexados. Permitió también obtener nuevos datos acerca de la anatomía reproductiva y de perfiles endocrinos que ayudaron a perfeccionar las bases de datos sobre esta especie.

Para delfines menores de 25 años, la tasa de embarazo se mantuvo incluso cuando se reducía cuatro veces la dosis de semen sexado usado en la IA y, teniendo en cuenta además, el lugar de deposición.  Son necesarios aun más estudios para poder confirmar con mayor seguridad que puede haber tasas de embarazo con bajas dosis de semen sexado.Se consiguió el nacimiento de 11 crías, habiendo sido obtenidas el 91% de ellas a partir de semen sexado, lo que pone de manifiesto la eficacia de la citometría de flujo como una herramienta adecuada para el mantenimiento de la ratio de sexos en poblaciones de delfín mular.
Aunque la senescencia reproductiva o disminución del éxito reproductivo con la edad se ha demostrado en delfines y otras especies de mamíferos, la contribución de aborto espontáneo a esta disminución se ha documentado recientemente y con esta investigación se ha vuelto a confirmar. En un estudio retrospectivo, se vio que mujeres sometidas a FIV que eran mayores de 35 años tenían casi el doble de incidencia de aborto espontáneo (35%) que las mujeres menores de 35 (22%) [8].  En vacas también hay estudios que corroboran estos resultados. Se cree que un factor clave para esta pérdida es la baja funcionalidad del cuerpo lúteo, que resulta en la secreción inadecuada de progesterona para el desarrollo de las glándulas secretoras, lo cual es esencial para sostener al embrión temprano. La suplementación con progesterona durante las primeras etapas del embarazo es una práctica muy común en la clínica humana y en algunas especies domésticas, ya que está considerada como un buen método para combatir los abortos en las etapas tempranas.

 Los resultados de este estudio demuestran la eficacia de la selección de esperma y la IA para la gestión de proporción de sexos en las poblaciones de delfines mulares.Las tasas de embarazo son mayores con espermatozoides sexados. Esto podrá reducir costes en la producción de crías de sexo deseado y mejorar el manejo de esta técnica en las poblaciones de delfines.

    La reducción de las tasa de aborto en hembras menores de 25 años nos indica que es adecuado seleccionar las hembras a las que se les va a realizar la IA para aumentar así la eficacia de los programas utilizando los espermatozoides sexados.

FIGURA 4. EJEMPLAR DE DELFÍN (TURSIOPS TRUNCATUS) CON SU CRÍA

Isabel Gutiérrez Díaz

Isabel M Sánchez Castelló

BIBLIOGRAFÍA

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2. O’Brien, J. K. & Robeck, T. R. The relationship of maternal characteristics and circulating progesterone concentrarions with reproductive outcome in the bottlenose dolphin (Tursiops truncatus) after artificial insemination, with and without ovulation induction, and natural breeding. Theriogenology, 78, 469-482 (2012)

3. O’Brien, J. K., Steinman, K. J. & Robeck, T. R. Application of sperm sorting and associated reproductive technology for wildlife management and conservation. Theriogenology 71, 98–107 (2009).

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1

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