Sexado del semen en ganadería: un presente con futuro

En 2011 la población mundial alcanzó los 7 billones de personas y ya se predice que esta cifra sobrepasará los 10 billones durante este siglo. Es por ello que, para responder a la creciente demanda de alimentos, sea necesario utilizar biotecnologías modernas que proporcionen una producción sostenible de productos de origen animal. La FAO (Organización de las Naciones Unidas para la Alimentación y la Agricultura) ha reconocido el sexado de semen como una de las estrategias más prometedoras para incrementar la producción de alimentos de forma rápida y económica. 

Los productores pueden tener las proporciones óptimas de machos y hembras con la utilización de semen sexado, según sean sus necesidades productivas: carne en el caso de los machos (ej.: toro, buey) y leche en el de las hembras (ej.: vaca, oveja). Además, este método incrementa la mejora genética de la raza mediante la selección de los progenitores y reduce la incidencia de enfermedades genéticas en el ganado. También hay un beneficio económico ya que se reducen los precios de estos alimentos.

En los mamíferos el sexo está determinado por los cromosomas sexuales X e Y; siendo la dotación cromosómica XX en las hembras y XY en los machos. El sexado de semen se basa en la diferencia de cantidad de ADN que hay entre el cromosoma X e Y. Estos cromosomas de diferencian en tamaño, siendo el cromosoma X el más grande y por tanto con una mayor cantidad de ADN.  La citometría de flujo es una técnica para separar espermatozoides basada en este hecho y que ya se utiliza en la producción de ganado vacuno. En 1988 se obtuvieron los primeros animales concebidos con semen sexado mediante esta técnica y desde entonces se ha utilizado en diferentes especies destinadas a producción.

En esta técnica el esperma es incubado con una molécula fluorescente que se une al ADN. Este marcador no es tóxico y además deja las membranas espermáticas intactas. Se une preferentemente a las regiones ricas en nucleótidos Adenina-Timina de la doble hélice de ADN.

 

A continuación, los espermatozoides pasan por un láser de luz ultravioleta que excita la emisión de fluorescencia del marcador y se detecta la diferencia de fluorescencia entre los cromosomas X e Y. Los espermatozoides reciben una carga eléctrica proporcional a su contenido de ADN y pasan por un campo electrostático que los separa en espermatozoides X e Y.

            

Actualmente existen, a disposición de la industria ganadera, equipos de citometría de flujo ultra-rápida que son capaces de obtener un enriquecimiento de la muestra con el sexo deseado del 90% en la mayoría de las especies animales domésticas.  Mediante esta técnica se pueden sexar hasta unos 20 millones de espermatozoides a la hora.

Es indiscutible que dicha técnica aporta grandes beneficios económicos en el campo de la ganadería, sin embargo, no debemos conformarnos con las tasas de éxito obtenidas, ya que durante dicho proceso de separación los espermatozoides sufren una serie de daños en su estructura que les provoca una disminución en su capacidad de movimiento y en su viabilidad. Esto provoca una importante bajada en la capacidad fecundante, variable en función de la especie en la que se realice el sexado, pero que hace evidente una disminución del éxito potencial de la técnica, en comparación con otros procedimientos de reproducción asistida clásicos.

Es por esto que, en los últimos años se buscan y desarrollan métodos alternativos a dicha clasificación de alta velocidad. Como, por ejemplo, el sistema, también de citometría, en el que se sustituye el campo electrostático, al que se le somete al espermatozoide por un láser que le evita daños a la hora de ser separado; gracias a lo que se reduce, en gran medida, el daño al espermatozoide, se mejoran las tasas de motilidad, y por tanto la capacidad fertilizante y la efectividad del proceso.

Sin meternos en detalles, para aquellos ganaderos o profesionales que se muevan en este campo, es interesante comentar algo sobre otra de las técnicas en desarrollo e investigación más novedosas. Se basa en la utilización de nanopartículas de oro que se integran en los espermatozoides de buena calidad.


Dicho sistema requiere, lo primero, del diseño de las nanopartículas para que puedan entrar e integrarse en el espermatozoide. Una vez dentro, se agrupan de diferente forma en función de si el espermatozoide porta el cromosoma X o el cromosoma Y. Y finalmente esta unión específica se diferencia mediante un análisis de los espectros de absorción de cada una de las células.

Pese a lo complejo que pueda parecer a priori todo el proceso, los espermatozoides no sufren daño alguno en su estructura, y por tanto su motilidad y viabilidad se mantiene intacta. Aun así, se siguen realizando investigaciones sobre si podría tener consecuencias a medio-largo plazo la acumulación de dichas nanopartículas,  tanto en el propio espermatozoide, como en las generaciones futuras.

Teniendo todo esto en cuenta, el sistema de nanopartículas de oro es un firme candidato a revolucionar el campo del sexado de semen en la ganadería, ya que podría permitir de forma rápida, “barata” y segura la obtención de animales a la carta, machos o hembras.

Tanto las técnicas mencionadas, como muchas otras en proceso de investigación y desarrollo, se justifican por los beneficios económicos obtenidos.  Veremos algunos ejemplos, para entender mejor la importancia de su uso:

- Ganado bovino:

En la actualidad aunque la técnica está disponible para varias especies, donde realmente está  perfeccionada, y por ello se usa más, es en el ganado bovino. Todos sabemos que la ganadería mueve mucho dinero, y al empresario no le interesa tener machos y hembras a la vez, sino sólo hembras productoras de leche, o sólo machos para obtener carne.

Las hembras sólo producen leche después de haber parido y si son ordeñadas regularmente, por lo que se usa la inseminación artificial cada año y medio o dos años para que vuelvan a parir y que así puedan seguir produciendo leche. La leche puede transformarse en productos lácteos muy diversos, como el queso, la mantequilla o el yogur. En la actualidad existe una importante industria desarrollada en torno a la producción de leche, de su transformación y de su distribución. La Unión Europea no sólo es una de las principales productoras, sino que también es una de las zonas donde más se consume tanto la leche como sus derivados.

La carne de vacuno es la tercera más comercializada tras la de cerdo y la de las aves de corral. Este tipo de carne puede tener dos orígenes principales, bien como un subproducto de la producción lechera, cuando el ganado que ha finalizado su etapa productiva en este sector se destina al aprovechamiento cárnico, o bien la cría de ganado con destino a la producción de carne; es aquí cuando al ganadero le interesan los machos, para obtener terneros.

Despiece de vacuno.

La industria bovina se extiende aún más, los machos se usan para corridas de toros, tradición española que, aunque no bien vista por todos, sigue moviendo grandes masas de dinero. Los toros, de los que sabemos que su semen es óptimo para fecundar, están muy bien valorados y su semen se vende caro (por ejemplo, en el centro de biotecnología animal del SERIDA en Gijón usan semen del toro Somedano, que les da unos buenos resultados de tasas de preñez). Ya en menor medida, los bueyes como animales de tiro y por su carne muy apreciada. Los cuernos se usaron mucho para fabricar peines y botones, y ahora se usan para los mangos de las navajas y cuchillos. Finalmente, el cuero bovino se usa en la marroquinería para hacer bolsos y carteras.

Queda demostrada pues, la importancia en este campo  de elegir si se quiere tener descendencia de machos o hembras.

- Porcino:

El cerdo se usa principalmente para la producción de carne, chorizo, jamón y muchos otros productos. Es un animal de granja interesante porque las hembras tienen un periodo corto de gestación y amplias camadas.

Despiece de cerdo.

Sería interesante el uso del sexado para evitar castraciones y para tener controlada la piara. Se castran para usarlos en la ceba y así tener jamón de gran calidad, pero también castrar lechones es una práctica habitual de las explotaciones porcinas, principalmente para evitar el olor en las carnes cuando éstas son cocinadas y consumidas. Las hormonas masculinas producen sustancias que se depositan en la grasa y provocan el mal olor.

Tras todo esto, diremos que aunque la citometría de flujo pueda ser útil en este campo en concreto, no se usa debido a su alto coste, y a que en el caso del cerdo se necesitan altas dosis de espermatozoides para fecundar. Se estudian nuevas técnicas para reducir la dosis necesaria y así poder aplicarla. Estas técnicas serían inyectar espermatozoides directamente en el útero o inseminar con laparoscopia.  No se usa la fecundación in vitro (FIV) con semen sexado porque tiene altas tasas de poliespermia (en lugar de entrar un espermatozoide en el ovocito entran varios a la vez). Se espera en un futuro que los costes de una técnica llamada ICSI (inyección intracitoplasmática de un espermatozoide) disminuyan, ya que los equipos son carísimos, y se pueda usar el espermatozoide sexado previamente, eligiendo además el de mejor calidad, para fecundar y evitar la poliespermia con éxito.

- Ovino:

Es una industria productora de leche, lana y carne, por lo que puede ser interesante el uso de semen sexado por las técnicas antes mencionadas.

En este caso, como no se usan las técnicas de fecundación in vitro ni de ICSI por producir resultados irregulares. Se sugiere el posible uso del semen sexado, congelado e inseminar después mayoritariamente por laparoscopia.

- Equino:

En este caso los pasos a seguir son refrigerar o congelar el semen, enviarlo a la instalación para procesar la muestra (separación espermática). Tas clasificarlo se congela nuevamente. Cuando el óvulo de la yegua esté disponible, se descongela y se utilizan los mejores espermatozoides. Ofreciendo así a los criadores de caballos una ICSI de espermatozoides de semen seleccionado.
Aquí tenemos los mismos problemas que con el ganado porcino, necesitamos altas dosis de espermatozoides y buscar nuevos métodos para reducir estas dosis. Podrían ser, por ejemplo, introducir un catéter en el útero. También se necesita perfeccionar la técnica de congelación usando antioxidantes tanto para congelar como para descongelar, y así evitar que el esperma resulte dañado.


Como hemos podido ver a lo largo del artículo, después de 30 años, el uso del semen sexado es aún una técnica restringida casi por completo al mundo de la ganadería, en concreto al sector bovino. En el futuro se pretenden combinar diferentes procedimientos como la citometría, con FIV, ICSI o nuevas tecnologías en desarrollo, para aumentar el rendimiento y la producción de diferentes especies ganaderas.

Si quieres una información más completa sobre el tema no dudes en visitar:  
Avances y aplicaciones del sexado de semen en especies ganaderas.

Bibliografía:

Guthrie, HD., Johnson, LA., Garrett, WM., Welch, GR. y Dobrinsky, JR., 2002. “Flow cytometric sperm sorting: effects of varying laser power on embryo developmentin swine”. Molecular Reproduction Development, 61 87-92.

Martínez-Pastor, F. y col., 2010. “Probes and Techniques for Sperm Evaluation by Flow Cytometry”. Reproduction in Domestic Animals, 45 (Suppl. 2), 67–78.

McKenzie, F., Faulds, K. y Graham, D., 2008. “LNA functionalized gold nanoparticles as probes for double stranded DNA through triplex formation”. Chemical Communications, 2367-2369.

Petrunkina, M., Harrison, P., 2011. “Cytometric Solutions in Veterinary Andrology: Developments, Advantages, and Limitations”. Cytometry Part A: 338 348, 2.

Rath, D., Barcikowski, S., de Graaf, S., y col., 2013. “Sex selection of sperm in farm animals: Status report and developmental prospects”. Reproduction, Jan 8;145(1):R15-30.

Schrand, AM., Rahman, MF., Hussain, SM., Schlager, JJ., Smith, DA. y Syed, AF., 2010. “Metal-based nanoparticles and their toxicity assessment”. Nanomedicine Nanobiotechnology, 2 544-568.

Shukla, R., Bansal, V., Chaudhary, M., Basu, A., Bhonde, RR. y Sastry, M., 2000. “Biocompatibility of gold nanoparticles and their endocytotic fate inside the cellular compartment: a microscopic overview”. Langmuir, 21, 10644–10654.

Spinaci, M., Vallorani, C., Bucci, D., Tamanini, C., y Galeati G.,2010. “Effects of antioxidants on boar spermatozoa during sorting and storage”. Animal Reproduction Science, Oct; 122(1-2): 58-65.

Taylor, U., Barchanski, A., Garrels, W., Klein, S., Kues, W., Barcikowski, S. y Rath, D., 2012. “Toxicity of gold nanoparticles on somatic and reproductive cells”. Advances in Experimental Medicine & Biology, 733: 125-33.

Autores:
María Barandalla Sobrados 

Santiago Rubén Carro Esteban 

Lucía Murias Torrecilla

^{Máster en Biología y Tecnología de la Reproducción 2012-2013}

^{Universidad de Oviedo}

Avances y aplicaciones del sexado de semen en especies ganaderas

Con la utilización de semen sexado los ganaderos pueden tener las proporciones óptimas de machos y hembras según sean sus necesidades productivas. Además, se incrementa la mejora genética mediante la selección de los parentales y se reduce la incidencia de enfermedades genéticas en el ganado.

Los gonosomas X e Y se diferencian en tamaño, siendo el cromosoma X más grande. El sexado de semen se basa en la diferencia de cantidad de ADN que hay entre el cromosoma X y el Y, ^[1].
  
La citometría de flujo es una técnica para separar espermatozoides que se utiliza, entre otros, en la producción de ganado vacuno. Los primeros experimentos de citometría de flujo con espermatozoides fueron llevados a cabo por Gledhill en 1982. Pero no fue hasta 1988 cuando se obtuvieron los primeros animales concebidos con semen sexado, ^[2].

El esperma es incubado con el fluorocromo Hoechst 33342 no genotóxico, que deja las membranas espermáticas intactas y que se une preferentemente a las regiones ricas en AT de la hélice de ADN. A continuación, los espermatozoides son excitados por un láser de luz UV. Los espermatozoides pasan de uno en uno confinados en pequeñas gotas y con la orientación correcta para que la cabeza quede enfrentada al láser; de esta forma dos detectores captan la diferencia de fluorescencia entre los cromosomas X e Y. Las gotas reciben una carga proporcional al contenido de ADN de las células y pasan por un campo electrostático que las separa en espermatozoides X e Y (Figura 1).

Figura 1. Sexado de semen mediante citometría de flujo 

(http://www.sexingtechnologies.com/articles/technique).

La citometría de flujo ha proporcionado resultados exactos y reproducibles. Con la actual citometría de flujo ultra-rápida se obtiene un enriquecimiento de la muestra con el sexo deseado del 90% en la mayoría de las especies animales.  Mediante esta técnica se pueden sexar unos 20 millones de espermatozoides a la hora, ^[2].

Sin embargo, ésta no es una técnica perfecta, y tiene una serie de desventajas, siendo la disminución de la esperanza de vida de los espermatozoides uno de los principales problemas. Este hecho es provocado por la inmersión de los propios espermatozoides en la gota de carga del citómetro y la deflexión que sufren al ser separados y caer sobre la superficie plana en la que son acumulados. La tensión electrostática que se les aplica, es similar a la electroporación, y se forman transitoriamente poros en la membrana. Esto disminuye su capacidad fecundante, en alrededor de un 30%. La exposición de los espermatozoides a un campo electrostático induce la formación de especies reactivas de oxígeno (ROS), lo que causa daños en sus membranas. En exceso pueden afectar a la integridad de la cola, sobre todo a la zona de la pieza intermedia, donde se encuentran los mecanismos necesarios para proporcionar motilidad al espermatozoide. Esta alteración contribuye a la reducción de la motilidad del esperma, la viabilidad y la capacidad fertilizante, ^[3].

Es por esto que, en los últimos años, se han buscado alternativas para dicha clasificación de alta velocidad. Como por ejemplo, una variación de la citometría de flujo tradicional, donde se modula la potencia del láser que se utiliza para excitar al fluorocromo. Disminuyendo de esta forma el daño que se le provoca al espermatozoide y mejorando las tasas de motilidad, ^[4].

Otra de las técnicas más novedosas se basa en un procedimiento totalmente diferente al de la citometría. Consiste en la selección de espermatozoides mediante el sistema Nanogold, el cual utiliza nanopartículas de oro que se unen específicamente a secuencias presentes en espermatozoides morfológica y funcionalmente intactos (Figura 2).

Figura 2. Esquema del sistema Nanogold (Modificado de Rath D. y col., 2013).

Como puede verse en el esquema, primero deben diseñarse las nanopartículas para que puedan penetrar y difundir por el interior del espermatozoide, ^[5]. A continuación, una vez dentro de la célula se distribuyen de forma diferencial, en función de si el espermatozoide es portador del cromosoma X o del Y; de tal forma que si se encuentra con un cromosoma Y se produce la hibridación no invasiva de la doble hélice de ADN con una sonda que lleva incluida la nanopartícula, ^[6].  Esta unión débil produce un desplazamiento batocrómico (fenómeno en el que la longitud de onda de absorción de una sustancia se desplaza hacia longitudes de onda mas grandes o de menos energía por efecto del solvente o por sustituyentes), en los espermatozoides que darán lugar a machos y no en los que den lugar a hembras.

Pese a lo prometedor de la nueva técnica, a día de hoy no se sabe con certeza las alteraciones que dichas partículas puedan provocar en el propio espermatozoide o en las células germinales de la siguiente generación, ^[7]. La información actual sobre la citotoxicidad de las nanopartículas es muy heterogénea, y depende de la línea celular en las que se integran. Aun así, en los pocos estudios que se ha hecho en relación con los gametos y el desarrollo del embrión, se ha visto que las nanopartículas de oro son relativamente inertes y menos tóxicas que, por ejemplo, las nanopartículas de plata; Y tan solo concentraciones elevadas de las mismas pueden afectar a la motilidad de los espermatozoides o a las tasas de fertilización, ^[8].

Se está desarrollando otra técnica aún no mencionada. Se trata del “reverse sorting”, el cual consiste en primero congelar las muestras de semen  y posteriormente proceder a su separación por sexos. Es muy útil sobre todo si el macho se encuentra lejos de la sala donde se procesan las muestras. Tras congelar se lavan los espermatozoides para eliminar las células muertas y otros compuestos que puedan interferir negativamente, obteniendo tan solo las células viables, que posteriormente se separan, e inseminan o se utilizan para realizar fecundación in vitro. También se puede proceder a una nueva congelación tras la separación.

Aunque en ganado ovino se prevee su uso comercial, desafortunadamente, en otro tipo de animales la técnica no ha tenido éxito. Recongelar el semen, por ejemplo de toro, hace bajar la calidad del mismo, disminuyendo las tasas de fertilidad y aumentando los abortos.

Tanto las técnicas mencionadas como muchas otras, en proceso de investigación y desarrollo, se justifican por los beneficios económicos reportados.  A continuación se muestran algunos ejemplos, para entender mejor la importancia de su uso, ^[2]:

- Ganado bovino:

Debido al impacto económico que conlleva este sector de la ganadería, a que la técnica en el mismo está puesta a punto, y a particularidades de estas especies animales, su uso está ampliamente distribuido.

A los ganaderos les interesa obtener hembras productoras de leche y derivados lácteos (secundariamente obtención de carne). Es por esto por lo que está ampliamente extendido el uso de la técnica TRA de inseminación artificial para preñar a la vaca cada año o año y medio, y así, tras el parto, obtener leche. Este mercado es fundamental en España, ya que en la Unión Europea es una de las principales productoras y consumidoras de este alimento.

Pero, por otro lado, a otro grupo del sector ganadero bovino le interesa obtener machos si su empresa se basa en la comercialización de carne; siendo la tercera más comercializada tras la de cerdo y la de aves de corral.

La industria bovina se extiende al uso de toros en festejos, de toros como sementales de alta calidad, artesanía (mangos de cuchillos y navajas) y marroquinería, quedando demostrado pues, la importancia en este campo de elegir si se quiere obtener descendencia de machos o hembras.

- Porcino:

El principal uso del porcino es como alimento.  Las hembras tienen un periodo corto de gestación y amplias camadas, por lo que sería interesante usar el sexado para controlar la manada y para evitar castraciones.

La castración es una práctica habitual en estas explotaciones, principalmente para evitar el olor en las carnes cuando éstas son cocinadas y consumidas. Las moléculas responsables del “olor macho” son la androstenona y el escatol principalmente. La androstenona es una feromona producida en los testículos del cerdo y que se acumula en la saliva del verraco y se libera en momentos de excitación, pero también se deposita en su grasa. El escatol es producto de la degradación bacteriana del triptófano, un aminoácido.

En el caso del cerdo se necesitan altas dosis de semen (número de espermatozoides /ml semen) para fecundar, por lo que el precio de la citometría aumenta. Es por lo que, es necesario recurrir a avances para reducir la dosis, como podría ser la técnica de inyección de espermatozoides directamente en el útero, o inseminar usando un laparoscopio. Actualmente, la FIV convencional no es una ténica muy utilizada porque en este animal tiene altas tasas de poliespermia; ni la ICSI ya que el aparataje necesario tiene un coste muy elevado. En el futuro, disminuyendo la dosis y abaratando los costes de ICSI, se preveen grandes éxitos, debido a que no solo obtenemos el sexo deseado, sino que además elegimos el espermatozoide de mejor calidad, consiguiendo incluso el descenso las tasas de poliespermia.

- Ovino:

Al igual que en otros tipos de ganado, esta industria se destina a la alimentación (carne y leche) y a la producción de lana. Por ello es interesante seleccionar el sexo de la descendencia según las necesidades productivas.

En este sector no se emplean las técnicas de FIV o ICSI. Se sugiere el uso de semen sexado, congelado, y mayoritartiamente se realizan las  inseminaciones por laparoscopia. No se usan otras técnicas de inseminación porque proporcionan resultados irregulares.

- Equino:

El procedimiento a seguir en este caso  es refrigerar o congelar el semen obtenido y enviarlo a la instalación para el sorting espermático. La muestra será clasificada y el semen se congela nuevamente en probetas. Cada tubo de ensayo se usa una sóla vez. Cuando el óvulo de la yegua esté disponible, se descongela la probeta y se utilizan los mejores espermatozoides. Ofreciendo así a los criadores de caballos una ICSI de espermatozoides de semen seleccionado.

En este tipo de ganado son necesarias altas dosis de espermatozoides, por lo que se buscan maneras de disminuir la dosis, al igual que ocurría en porcino. Se necesita mejorar la congelación usando antioxidantes tanto para congelar para descongelar, evitando que el esperma resulte dañado.

Tras 30 años de desarrollo, el uso del semen sexado es hoy en día una práctica práctica casi exclusiva del sector ganadero, siendo muy limitado su uso para otros animales de granja o incluso para humanos. 

Pese a los grandes avances que se han conseguido en el aumento de la velocidad de separado por citometría de flujo, el mayor problema sigue siendo la obtención de dosis muy bajas, por lo que hay baja fecundación, y esto limita su uso comercial.

En el futuro se pretenden combinar diferentes procedimientos como la citometría de flujo, con FIV, ICSI o nuevas tecnologías en desarrollo, como el sistema Nanogold, para aumentar el rendimiento y la producción de diferentes especies ganaderas.

Bibliografía: 

[1] Martínez-Pastor, F. y col., 2010. “Probes and Techniques for Sperm Evaluation by Flow Cytometry”. Reproduction in Domestic Animals, 45 (Suppl. 2), 67–78.

[2] Rath, D., Barcikowski, S., de Graaf, S., y col., 2013. “Sex selection of sperm in farm animals: Status report and developmental prospects”. Reproduction, Jan 8;145(1):R15-30.

[3] Spinaci, M., Vallorani, C., Bucci, D., Tamanini, C., y Galeati G.,2010. “Effects of antioxidants on boar spermatozoa during sorting and storage”. Animal Reproduction Science, Oct; 122(1-2): 58-65.

[4] Guthrie, HD., Johnson, LA., Garrett, WM., Welch, GR. y Dobrinsky, JR., 2002. “Flow cytometric sperm sorting: effects of varying laser power on embryo developmentin swine”. Molecular Reproduction Development, 61 87-92.

[5] Shukla, R., Bansal, V., Chaudhary, M., Basu, A., Bhonde, RR. y Sastry, M., 2000. “Biocompatibility of gold nanoparticles and their endocytotic fate inside the cellular compartment: a microscopic overview”. Langmuir, 21, 10644–10654.

[6] McKenzie, F., Faulds, K. y Graham, D., 2008. “LNA functionalized gold nanoparticles as probes for double stranded DNA through triplex formation”. Chemical Communications, 2367-2369.

[7] Taylor, U., Barchanski, A., Garrels, W., Klein, S., Kues, W., Barcikowski, S. y Rath, D., 2012. “Toxicity of gold nanoparticles on somatic and reproductive cells”. Advances in Experimental Medicine & Biology, 733: 125-33.

[8] Schrand, AM., Rahman, MF., Hussain, SM., Schlager, JJ., Smith, DA. y Syed, AF., 2010. “Metal-based nanoparticles and their toxicity assessment”. Nanomedicine Nanobiotechnology, 2 544-568.

Autores:
María Barandalla Sobrados 

Santiago Rubén Carro Esteban 

Lucía Murias Torrecilla

^{Máster en Biología y Tecnología de la Reproducción 2012-2013}

^{Universidad de Oviedo}