SEXADO ESPEMÁTICO MEDIANTE CITOMETRÍA DE FLUJO: FUNDAMENTOS BIOLÓGICOS, APLICACIONES REPRODUCTIVAS Y LIMITACIONES TÉCNICAS

 INTRODUCCIÓN

El control del sexo de la descendencia ha sido un objetivo perseguido tanto en el campo de la reproducción animal como en la humana. En el ámbito ganadero esta técnica tiene gran relevancia debido a sus implicaciones económicas, productivas y genéticas. La posibilidad de obtener machos o hembras permite optimizar los sistemas de explotación, acelerar los programas de mejora genética, favorecer el bienestar animal y reducir el impacto ambiental asociado a la producción ganadera (Yadav et al., 2017). Debido a todo esto, el desarrollo de tecnologías reproductivas capaces de separar espermatozoides portadores de los cromosomas sexuales X e Y ha representado un gran avance, principalmente en el campo de la ganadería.

A partir de la década de 1980 se empezó a aplicar la citometría de flujo como una herramienta para separar espermatozoides según su cromosoma sexual. Sin embargo, para que esta tecnología alcanzara un grado de desarrollo suficiente para su comercialización y uso en programas de inseminación artificial (IA) en bovinos fueron necesarios aproximadamente veinte años (Álvarez Gallardo et al., 2024). Actualmente la citometría de flujo representa el único método científicamente válido capaz de separar espermatozoides portadores de los cromosomas X e Y con unas tasas de error muy bajas, especialmente en la especie bovina (Garner et al., 2013).

En el siguiente artículo se exponen los fundamentos biológicos del sexado espermático, el desarrollo y funcionamiento de la citometría de flujo aplicada a esta finalidad, y cuáles son los efectos de esta técnica sobre la calidad y sobre la fertilidad del semen. Además, se hace una revisión de las aplicaciones reproductivas actuales, las limitaciones técnicas del procedimiento y las alternativas emergentes. En último lugar se tratan las implicaciones éticas asociadas a la selección del sexo.

 

FUNDAMENTOS BIOLÓGICOS DEL SEXADO ESPERMÁTICO

En los mamíferos, la determinación del sexo es estrictamente cromosómica y depende de cuál es el cromosoma sexual que porta el espermatozoide que fecunda al ovocito. El macho produce dos tipos de espermatozoides: aproximadamente la mitad contienen el cromosoma X (esperma X) y la otra mitad el cromosoma Y (esperma Y), mientras que el ovocito producido por la hembra siempre porta un único cromosoma X (Yadav et al., 2017). Todas las técnicas de sexado espermático se basan en la base biológica de dicha diferencia cromosómica.

El cromosoma X cuenta con una mayor cantidad de material genético que el cromosoma Y. Esto se traduce en una diferencia cuantificable en el contenido de ADN entre los espermatozoides X e Y. La diferencia de material genético en el ganado bovino es aproximadamente de un 3,8-4,0 %. Este porcentaje, aun pareciendo muy bajo, es  suficiente para ser detectado mediante técnicas de citometría de flujo de alta resolución (Garner et al., 2013). Estudios realizados en especies domésticas confirmaron diferencias similares, con valores del 3,7 % en cerdos, 4,1 % en ovejas y 3,9 % en conejos (Álvarez Gallardo et al., 2024).

Figura 1. Ilustración que muestra una comparación del contenido relativo de ADN de núcleos de espermatozoides de conejo teñidos con Hoechst 33342, espermatozoides vivos X e Y, y núcleos recuperados de espermatozoides clasificados como Y y como X. (a) Ejemplo ilustrativo de la diferencia del 3,0 % en el contenido de ADN entre los núcleos de espermatozoides X e Y; (b) ejemplo de la diferencia relativa en el contenido de ADN de espermatozoides vivos intactos teñidos con Hoechst 33342; (c) representación de la distribución de frecuencias del contenido de ADN a partir del reanálisis de núcleos de espermatozoides de conejo preparados a partir de una alícuota de espermatozoides vivos clasificados como Y; y (d) representación de la distribución de frecuencias del contenido de ADN a partir del reanálisis de núcleos de espermatozoides de conejo preparados a partir de una alícuota de espermatozoides vivos clasificados como X (Garner et al., 2013).

La identificación de estas diferencias en el contenido de ADN logró superar las estrategias anteriores basadas en características morfológicas o funcionales, que no ofrecían resultados reproducibles ni científicamente significativos. Gracias a esto se sentaron las bases para el desarrollo de métodos objetivos de separación espermática.

 

DESARROLLO DE LA CITOMETRÍA DE FLUJO PARA EL SEXADO ESPERMÁTICO

Como ya ha sido expuesto, la citometría de flujo permitió separar espermatozoides en función de su contenido de ADN. El siguiente objetivo en el desarrollo de la tecnología de sexado espermático fue la cuantificación precisa del ADN de los espermatozoides con cromosomas X e Y en distintas especies domésticas. Este avance fue determinante para validar si este método podría tener aplicaciones en condiciones experimentales y, posteriormente, comerciales (Álvarez Gallardo et al., 2024).

Durante los primeros años, la limitación principal del uso de la citometría de flujo era la necesidad estricta de emplear métodos que comprometían la viabilidad celular tanto para la tinción como para la selección de espermatozoides. Como consecuencia de esto, uno de los objetivos principales fue lograr la selección de espermatozoides viables que pudieran utilizarse en inseminación artificial sin que se vea comprometida su capacidad fecundante (Álvarez Gallardo et al., 2024).

Se han llevado a cabo estudios orientados a evaluar el proceso de congelación del semen sexado, posible gracias al uso del citómetro de flujo MoFlow SX™, que permitía obtener un número suficiente de espermatozoides para su criopreservación. Los resultados concluyeron que la intensidad del láser utilizado durante el proceso de sexado influía directamente en la motilidad progresiva post-descongelación. En los datos obtenidos se observa que un láser de 100 mW afectaba menos la motilidad que uno de 150 mW. Por otro lado, también se llegó a la conclusión de que era determinante el tipo de diluyente empleado para preservar tanto la motilidad como la integridad acrosómica. A pesar de que el semen sexado presentó valores ligeramente inferiores en comparación con el semen convencional, estas diferencias no eran suficientemente significativas como para impedir su uso en inseminación artificial comercial (Álvarez Gallardo et al., 2024).

Estos avances marcaron un punto clave en la consolidación de la citometría de flujo como una de las principales herramientas aplicable en programas reproductivos bovinos.

 

PRINCIPIOS TÉCNICOS DEL SEXADO ESPERMÁTICO POR CITOMETRÍA DE FLUJO

El proceso del sexado espermático comienza con la tinción del ADN nuclear utilizando un fluorocromo denominado Hoechst 33342, que es un colorante que se une de forma estequiométrica al ADN. Una vez teñidos, los espermatozoides se excitan mediante un láser ultravioleta, y la intensidad de fluorescencia emitida es proporcional a su contenido de ADN. Debido a esto, los espermatozoides portadores del cromosoma X contienen más ADN que aquellos portadores del cromosoma Y, por lo que es posible su segregación en función de esta señal fluorescente (Garner et al., 2013).

Para que la medición sea precisa, es imprescindible que los espermatozoides pasen individualmente por el haz láser y con una orientación adecuada de la cabeza. Esto se logra mediante sistemas de flujo laminar y boquillas especializadas, constituyendo uno de los principales factores limitantes del proceso desde el punto de vista técnico (Garner et al., 2013).

Una vez detectada la fluorescencia, el citómetro establece ventanas de clasificación específicas para espermatozoides X, espermatozoides Y, y una población intermedia en la que los espermatozoides no pueden ser clasificados con certeza, por lo que son descartados. Posteriormente, cada espermatozoide se encapsula en una microgota que recibe una carga eléctrica en función del tipo cromosómico detectado. Las gotas con carga son desviadas hacia los distintos colectores mediante campos electrostáticos, y se logra así la separación física de las poblaciones X e Y (Garner et al., 2013).

La tecnología de citometría de flujo para la separación espermática presenta tasas de precisión de entre el 85 y el 95 %. Esta cifra varía en función de  la especie, la calidad del semen y la optimización del equipo. Sin embargo, la velocidad de clasificación es relativamente baja, del orden de 10.000 a 20.000 espermatozoides por segundo, lo que obliga a producir dosis seminales con una concentración espermática menor a la del semen convencional. Esta disminución, unido al posible daño que induce esta tecnología a los espermatozoides, puede explicar en gran medida el menor rendimiento reproductivo observado (Garner et al., 2013).

Figura 2. Citómetro de flujo para la clasificación de espermatozoides que muestra cómo los espermatozoides teñidos con Hoechst 33342 son impulsados a través del sistema de clasificación, incluyendo: (a) el vibrador de cristal piezoeléctrico (~70.000/s), que provoca que el flujo forme gotas al salir del sistema; (b) los pulsos de láser ultravioleta que iluminan a los espermatozoides a medida que fluyen por el sistema dentro del flujo; (c) los dos fotodetectores de fluorescencia que capturan las emisiones fluorescentes a 0° y 90°; (d) la señal de fluorescencia es cuantificada y clasificada como X, Y o indeterminada; (e) se aplica una carga positiva, negativa o ninguna carga a las gotas a medida que emergen del flujo; (f) al pasar las gotas cargadas entre dos placas con cargas opuestas, estas son desviadas hacia los tubos colectores X o Y según su contenido de ADN, mientras que las gotas sin espermatozoides, aquellas con membranas celulares comprometidas o aquellas que contienen espermatozoides con contenido de ADN incierto pasan directamente al contenedor de no clasificados (Garner et al., 2013).

 

IMPACTO DEL SEXADO SOBRE LA CALIDAD ESPERMÁTICA

Uno de los pasos más importantes en dicha tecnología es el análisis del impacto del sexado sobre la calidad espermática. El procedimiento es una combinación de diferentes aspectos que son potencialmente dañinos, como la tinción con fluorocromos, la exposición a radiación ultravioleta, la presión hidrodinámica elevada y la aplicación de campos eléctricos. Estos factores tienen el poder de genera un daño celular acumulativo, viéndose así afectados diversos parámetros funcionales del espermatozoide.

Algunos ejemplos de daños que sufre el espermatozoide como consecuencia de esta técnica son: disminución de la motilidad, disminución de la integridad de las membranas plasmática y acrosomal, y disminución de la longevidad espermática. Sin embargo, el descenso en la fertilidad asociado al semen sexado no está relacionada con el tipo cromosómico del espermatozoide, sino con las exigencias físicas y tecnológicas inherentes al procedimiento de separación (Garner et al., 2013).

Diversos estudios han indicado que la integridad del ADN no se ve afectada por el proceso de sexado, y que tampoco se inducen cambios detectables en la metilación de genes clave como IGF2 e IGF2R. Sin embargo, se reconoce la necesidad de realizar más investigaciones para evaluar posibles efectos epigenéticos adicionales (Carvalho et al., 2014).

 

EFECTOS REPRODUCTIVOS Y APLICACIONES DEL SEMEN SEXADO

En términos reproductivos, el uso de semen sexado en bovinos suele dar lugar a tasas de fertilidad entre un 10 y un 30 % inferiores a las obtenidas con semen no sexado (Garner et al., 2013). En inseminación artificial a celo detectado, las tasas de preñez con semen sexado suelen ser entre un 5 y un 35 % inferiores. Esto se debe principalmente al menor número de espermatozoides por dosis y al daño celular inducido durante el proceso de sexado (Oses et al., 2009).

La inseminación artificial a tiempo fijo (IATF), que se basa en la sincronización hormonal del celo, permite inseminar a las hembras en un momento predeterminado, sin necesidad de detectar el celo de forma natural. En este contexto, el uso de dosis adecuadas y una correcta sincronización puede permitir resultados cercanos a los obtenidos en IA a celo detectado, aunque factores como la intensidad del celo continúan influyendo.

El semen sexado también se utiliza en programas de transferencia embrionaria (TE) y fertilización in vitro (FIV) para producir embriones de alto valor genético y de un sexo específico. En estos sistemas, la cantidad de ovocitos fecundados y de embriones transferibles suele ser menor y presenta una elevada variabilidad, dependiendo del toro y de la preparación del semen. No obstante, estudios indican que las tasas de segmentación y de formación de blastocistos no presentan diferencias significativas entre el semen sexado y el no sexado, ni se observan diferencias en la cinética de desarrollo embrionario (Carvalho et al., 2010).

 

ESTRATEGIAS PARA OPTIMIZAR LA EFICACIA DEL SEMEN SEXADO

El semen sexado presenta una menor longevidad y resistencia en el tracto genital femenino. Debido a esto es recomendable llevar a cabo la inseminación artificial lo más cerca posible del momento de la ovulación. Esta estrategia reduce el tiempo de exposición de los espermatozoides en condiciones potencialmente adversas, asegurando así que haya un mayor número de células viables en el momento de la fertilización (Carvalho et al., 2014).

Por otro lado, la selección espermática mediante gradientes de Percoll ha demostrado mejorar la motilidad espermática tras la descongelación, aunque también incrementa la concentración de aglutinaciones cabeza-cabeza, sin afectar la integridad del ADN ni la morfología celular (Carvalho et al., 2010).

 

ALTERNATIVAS AL SEXADO POR CITOMETRÍA DE FLUJO

La citometría de flujo continúa siendo el único método científicamente validado para el sexado de espermatozoides viables. No obstante, esta tecnología presenta limitaciones importantes, como el daño espermático, los altos costos, la complejidad técnica y las menores tasas de preñez, impulsando así la búsqueda de alternativas más eficientes, económicas y no invasivas (Yadav et al., 2017).

Las diferencias genómicas entre espermatozoides X e Y sugieren la existencia de diferencias proteicas en su superficie, lo que ha motivado el desarrollo de estrategias basadas en proteínas específicas del sexo. Aunque el antígeno H‑Y no ha demostrado ser un marcador fiable, la identificación de proteínas específicas del sexo (SSP) continúa siendo una línea de investigación relevante. Estudios de proteómica han identificado proteínas diferencialmente expresadas entre espermatozoides X e Y. Entre estas destaca SACA1, considerada un candidato prometedor para la separación espermática basada en anticuerpos (Bai et al., 2025; Yadav et al., 2017).

Los métodos inmunológicos han mostrado resultados alentadores. En porcino, el uso de anticuerpos monoclonales específicos para espermatozoides Y permitió una separación eficiente mediante MACS (Magnetic‑Activated Cell Sorting), logrando una alta afinidad y especificidad por las células Y y manteniendo una calidad seminal adecuada (Chot et al., 2026). La proteómica espermática ha reforzado este enfoque al identificar marcadores adicionales como CLRN3 y SCAMP1, que podrían emplearse para inmunoselección (Bai et al., 2025).

Otra alternativa emergente son los aptámeros, oligonucleótidos sintéticos capaces de unirse con alta especificidad a proteínas de la superficie espermática. Estudios recientes demuestran que los aptámeros pueden diferenciar entre espermatozoides X e Y sin inducir daño celular, lo que los convierte en una opción económica, rápida y no invasiva para el sexado espermático (Singh et al., 2025).

Además, se han explorado métodos bioquímicos basados en diferencias funcionales entre espermatozoides X e Y. En búfalo, la activación diferencial de los receptores TLR7/8 mediante el agonista R848 permitió separar espermatozoides en función de su motilidad, afectando también la proporción de embriones macho y hembra obtenidos tras la fecundación (Meel et al., 2025).

Estos avances confirman que existen diferencias reales y aprovechables entre espermatozoides X e Y a nivel proteico y funcional, lo que respalda el desarrollo de métodos inmunológicos, proteómicos, bioquímicos y basados en aptámeros como alternativas prometedoras a la citometría de flujo (Yadav et al., 2017; Bai et al., 2025; Choi et al., 2026; Singh et al., 2025; Meel et al., 2025).

 

CONSIDERACIONES ÉTICAS SOBRE LA SELECCIÓN DEL SEXO

En el ámbito de la reproducción humana, la selección espermática con fines de control del sexo no se utiliza de forma rutinaria, debido a las controversias éticas, sociales y legales que genera. A diferencia de lo que ocurre en reproducción animal, donde la separación de espermatozoides X e Y tiene aplicaciones consolidadas, en humanos la selección del sexo solo se permite en determinados países y exclusivamente por razones médicas, principalmente para evitar enfermedades graves ligadas a los cromosomas sexuales (Eftekhaari et al., 2015).

En estos casos, la selección no se realiza a partir de espermatozoides, sino mediante el análisis genético de embriones obtenidos por fecundación in vitro. Técnicas como el diagnóstico genético preimplantacional (DGP) permiten identificar el sexo del embrión antes de su transferencia, sin basarse en la carga cromosómica de los espermatozoides utilizados (“Preconception gender selection for nonmedical reasons,” 2004).

No obstante, algunos países permiten la selección del sexo sin necesidad de justificar una causa médica, lo que ha generado un debate ético significativo sobre el uso no terapéutico de estas tecnologías y sus posibles consecuencias sociales, como el desequilibrio en la proporción de sexos o la discriminación de género (Eftekhaari et al., 2015).

 

CONCLUSIONES

La citometría de flujo ha consolidado su posición como el único método científicamente validado para el sexado de espermatozoides viables, permitiendo el control del sexo de la descendencia en bovinos con un alto grado de precisión. Esta herramienta presenta ciertas limitaciones técnicas, además de un potencial impacto negativo sobre ciertos parámetros de calidad espermática. Sin embargo, el semen sexado constituye una herramienta viable en programas reproductivos avanzados, siempre que se optimicen las condiciones de manejo y aplicación.

El desarrollo de alternativas basadas en métodos inmunológicos y proteómicos, junto con una reflexión ética continua, será clave para el futuro de las tecnologías de sexado espermático y su aplicación responsable tanto en el ámbito animal como humano.

 

BIBLIOGRAFÍA

Álvarez Gallardo, H., Urbán Duarte, D., Velázquez Roque, A., De La Torre Sánchez, J.F., 2024. Uso y evolución del sexado espermático en bovinos. Revisión. Rev. Mex. Cienc. Pecu. 15, 641–668. https://doi.org/10.22319/rmcp.v15i3.6372

Bai, L., Zhao, Y., Zhou, Y., Song, Y., Xiao, H., Zhao, G., Wang, Z., Li, X., 2025. Advances in immunological sorting of X and Y chromosome-bearing sperm: from proteome to sex-specific proteins. Front. Vet. Sci. 12. https://doi.org/10.3389/fvets.2025.1523491

Carvalho, J.O., Sartori, R., Dode, M.A.N., 2014. Different ways to evaluate bovine sexed sperm in vitro.

Carvalho, J.O., Sartori, R., Machado, G.M., Mourão, G.B., Dode, M.A.N., 2010. Quality assessment of bovine cryopreserved sperm after sexing by flow cytometry and their use in in vitro embryo production. Theriogenology 74, 1521–1530. https://doi.org/10.1016/j.theriogenology.2010.06.030

Chot, O., Thongkham, M., Satsook, A., Paitoon, P., Arjin, C., Mekchay, S., Sathanawongs, A., Hongsibsong, S., Sringarm, K., 2026. Efficiency of magnetic-activated cell sorting using Y-specific monoclonal antibodies on the quality of porcine sexed semen. Theriogenology 251, 117752. https://doi.org/10.1016/j.theriogenology.2025.117752

Eftekhaari, T.E., Nejatizadeh, A.A., Rajaei, M., Soleimanian, S., Fallahi, S., Ghaffarzadegan, R., Mahmoudi, F., 2015. Ethical considerations in sex selection. J. Educ. Health Promot. 4, 32. https://doi.org/10.4103/2277-9531.157184

Garner, D., Evans, K., Seidel, G., 2013. Sex-Sorting Sperm Using Flow Cytometry/Cell Sorting. Methods Mol. Biol. Clifton NJ 927, 279–95. https://doi.org/10.1007/978-1-62703-038-0_26

Meel, M., Gaur, M., Punetha, M., Dahiya, P., Mangal, M., Bala, R., Ghanghas, P., Bansal, K., Kumar, D., Sharma, R.K., Datta, T.K., Kumar, P., 2025. Use of R848, a TLR 7/8 agonist to separate X and Y spermatozoa in buffalo: effects on cleavage rates, blastocyst production, and the ratio of male to female embryos. Theriogenology 247, 117576. https://doi.org/10.1016/j.theriogenology.2025.117576

Oses, M.V., Teruel, M.T., Cabodevila, J.A., 2009. Utilización de semen bovino sexado en inseminación artificial, transferencia embrionaria y fertilización in vitro. Rev. Vet. 20, 138–145. https://doi.org/10.30972/vet.2021867

Preconception gender selection for nonmedical reasons, 2004. . Fertil. Steril. 82, 232–235. https://doi.org/10.1016/j.fertnstert.2004.05.013

Singh, S.K., Kumar, R., Vats, P., Gangwar, D.K., Mathur, M., Rani, R., Kaushik, J.K., Mohanty, A.K., Kumar, S., 2025. Aptamer-based selective enrichment of X and Y sperm: A new frontier in livestock breeding. Int. J. Biol. Macromol. 329, 147816. https://doi.org/10.1016/j.ijbiomac.2025.147816

Yadav, S.K., Gangwar, D.K., Singh, J., Tikadar, C.K., Khanna, V.V., Saini, S., Dholpuria, S., Palta, P., Manik, R.S., Singh, M.K., Singla, S.K., 2017. An immunological approach of sperm sexing and different methods for identification of X- and Y-chromosome bearing sperm. Vet. World 10, 498–504. https://doi.org/10.14202/vetworld.2017.498-504