Autor: Ana Isabel Martínez López
Máster de Técnicas de reproducción asistida
Análisis Funcional del Espermatozoide
En Gijón a 15/01/2023
Con el objetivo de aumentar las tasas de éxito asociadas con los problemas de infertilidad masculina, se están impulsando nuevos avances en las técnicas de selección de espermatozoides basadas en la calidad espermática.
Debido a la etiología múltiple y variada de los problemas de infertilidad masculina, ninguna técnica de las desarrolladas en la actualidad ha logrado erigirse como un método de selección “estándar de oro”. Existen diferentes procedimientos que son usados para la práctica clínica en la actualidad: Centrifugación por gradiente de densidad y swim-up; método del potencial zeta; unión del ácido hialurónico; clasificación celular activada magnéticamente (MACS); prueba de hinchazón hipoosmótica (HOST); selección de espermatozoides inmóviles asistida por láser (LAISS); microfluídica; examen de la morfología de los orgánulos móviles del espermatozoide (MSOME), y métodos experimentales adicionales: Prueba de flexibilidad de la cola del espermatozoide (STFT), birrefringencia e inteligencia artificial
Todas las técnicas tienen ventajas e inconvenientes y esto implica un desafío para el embriólogo que debe ser elegir, la técnica más adecuada para cada paciente, sin poder guiarse mediante protocolos estandarizados.
Los avances en el diagnóstico y tratamiento de la infertilidad mediante el desarrollo de sistemas de microfluídica que mimetizan el proceso de selección en el tracto reproductivo femenino (TRF) son prometedores y han dado como resultado la selección de espermatozoides con un potencial de fertilización mejorado y mayor integridad del ADN.
La microfluídica es capaz de integrar los mecanismos de interacción de la diferente geometría, fluido, entorno químico y temperatura con el tracto reproductor femenino reconstruyendo el entorno natural in vivo.
Entre los beneficios del empleo de las técnicas de Microfluídica se encuentran: La capacidad de simular el cuerpo humano; manipular espermatozoides a microescala y capacidad de procesar muestras de bajo volumen; biocompatibilidad; naturaleza no invasiva de los dispositivos; reducir el tiempo de procesamiento disminuyendo la generación de ROS, responsable de la fragmentación del ADN; automatización de los procedimientos; y posibilidad de integrar varias de las etapas de procedimientos propios de las Técnicas de Reproducción Asistida (TRA), como la separación de esperma, la vitrificación, la denudación de ovocitos, la inseminación, etc., en un solo dispositivo microfluídico, disminuyendo el coste total de los tratamientos1.
En los últimos años, se han propuesto multitud de dispositivos microfluídicos con diferentes propósitos que pretendemos mostrar a continuación, así como los principios científico-técnicos en los que basan su funcionamiento.
2. Mecanismos de Microfluídica inspirados en los procedimientos de selección natural que mimetizan los procesos del TRF
El TRF presenta un entorno desafiante con pasajes estrechos, caminos intrincados y fluidos viscosos, todos obstáculos para las células espermáticas en su camino hacia la fertilización. Para superar estos desafíos, las células espermáticas han desarrollado la capacidad de mostrar quimiotaxia, termotaxia, reotaxia y thigmotaxia también conocida como comportamiento de seguimiento de límites.
En ausencia de los estímulos guía específicos que se producen dentro del TRF, las condiciones ambientales se convierten en la causa principal del movimiento del espermatozoide y en ausencia de estímulos externos el movimiento del espermatozoide se caracteriza por ser completamente aleatorio.
Uno de los factores ambientales más significativos en la selección de los espermatozoides de mayor calidad durante su viaje, es la viscosidad del entorno. Esta dificulta el paso de los espermatozoides más débiles, mientras que los espermatozoides más rápidos y persistentes tienen la capacidad de migrar a pesar de esta.
El otro factor ambiental además de la viscosidad que influye en el movimiento del esperma hacia el óvulo es la presencia de obstáculos de flujo. Estos se forman cuando dos flujos laminares con diferentes velocidades convergen. En este escenario, los espermatozoides más fuertes y móviles pueden orientarse hacia estos obstáculos y atravesarlos, mientras que los componentes restantes del líquido seminal no pueden hacerlo.
El reto para los investigadores consiste en replicar estos procesos naturales en el laboratorio con materiales y reactivos biocompatibles y atóxicos, para lo que tendrán que diseñar nuevos dispositivos de microfluídos.
Para imitar la viscosidad del moco cervical los dispositivos de microfluidos utilizan diferentes medios como la polivinilpirrolidona (PVP), soluciones de metilcelulosa (MC) en diferentes concentraciones, y solución de fluido tubárico humano (HTF).
En la Imagen 1. se muestra un procedimiento experimental para una prueba de motilidad espermática inspirado en la viscosidad del fluido. Se añadió solución de metilcelulosa (MC) al 5%, solución de metilcelulosa (MC) al 4% y solución de fluido tubárico humano (HTF), respectivamente. Se pipeteó una muestra de semen de 1 mL en la entrada del dispositivo microfluídico (los círculos rojos indican la posición de los espermatozoides móviles), luego se realizó un análisis de motilidad de rendimiento de espermatozoides. El mayor número de espermatozoides móviles se congregó en la solución de HTF.
Fig.1.https://www.mdpi.com/micromachines/micromachines-1100793/article_deploy/html/images/micromachines-11-00793-g003-550.jpg
Los espermatozoides atraviesan regiones con fluidos altamente viscosos en el TRF para llegar al óvulo. Algunos espermatozoides son capaces de nadar a menos de 1 μm del sustrato mientras el flagelo se bate en un plano paralelo a la superficie. Este modo de natación plana 2D es prevalente en fluidos de alta viscosidad. Los espermatozoides que se mueven en 2D nadan un 50% más rápido, esto se atribuye a la reducción de la fuerza de arrastre y a la mayor eficiencia de la locomoción plana. La alta viscosidad del TRF podría favorecer a los espermatozoides que mueven la cola en 2D, pudiendo influir en la selección de los espermatozoides y en la capacidad de fertilización natural6.
Con esta idea se diseñó un dispositivo con una serie de canales de 2 μm de profundidad que conectan un canal de entrada con otro de salida (Imagen 3). Estos puentes impiden la rotación de la cabeza del espermatozoide de forma que solo los espermatozoides con capacidad para nadar y desplazarse de forma planar pueden atravesarlos llegando al canal de salida. El análisis posterior de los espermatozoides demostró que los espermatozoides capaces de nadar batiendo el flagelo en un plano de 2D presentan mayor integridad del ADN en comparación con los espermatozoides que nadan con un movimiento tipo sacacorchos6.
2.1. Dispositivos Inspirados en la Quimiotaxis
Los quimioatrayentes son moléculas secretadas por los ovocitos con el fin de guiar a los espermatozoides a su encuentro dentro del TRF. Al entrar en contacto con estas moléculas, los receptores específicos de la membrana del flagelo espermático se unen a estas y se activan produciendo cambios en el patrón de batido de la cola, permitiéndole nadar en una trayectoria más recta hacia el ovocito.
Algunos dispositivos de microfluídica tratan de estimular este comportamiento quimotáxico del espermatozoide creando un gradiente de concentración con algunas de estas moléculas, progesterona, CCL21, CCL19, acetilcolina, ...
El inconveniente de los dispositivos que funcionan por quimiotaxis es que las muestras necesitan capacitarse previamente en el laboratorio, ya que sólo los espermatozoides capacitados podrán responder a la atracción del quimioatrayente, y esto incrementa los tiempos de laboratorio para la selección de los espermatozoides y el daño por especies reactivas de Oxigeno (ROS).
En el dispositivo que se muestra en las Imágenes 4 y 5., se crea un gradiente con el quimioatrayente de elección, posteriormente se completa el trayecto del dispositivo con un medio de líquido tubárico humano (HTF) y se añade una muestra de esperma capacitado mediante gradientes de Percol. Incubamos el dispositivo a 37 °C durante 150 minutos y después podemos recoger los espermatozoides elegidos en la cámara de recogida final (G).
Imagen 4. Diagrama de la estructura del dispositivo. A: cámara de muestras; F: cámara de control; G: cámara quimiotáctica; Posición C, simula el útero; Posición B, simula el cuello uterino. D1, D2 y D3, ranuras entre C y la Cámara F; E1, E2 y E3, las ranuras entre C y la Cámara G; Las ranuras contienen el agar mezclado con el quimio-atráyente que forma el gradiente.
Fig.4. https://link.springer.com/article/10.1186/s12967-018-1575-7/figures/1
Imagen 5. https://link.springer.com/article/10.1186/s12967-018-1575-7/figures/2
2.2. Dispositivos Inspirados en la Termotáxia
Los espermatozoides fluyen a través de las trompas de Falopio guiándose por un gradiente de temperatura que se produce en el interior de estas. Los espermatozoides reaccionan a la diferencia de temperatura gracias a unas proteínas sensibles a la temperatura situadas en la membrana celular. Tras detectar cambios de temperatura, estos sensores activan una serie de señales que pueden activar canales iónicos y moléculas dentro de la célula. Esto provoca cambios en el potencial eléctrico del esperma y desencadenan el movimiento flagelar. El golpe coordinado del flagelo impulsa al espermatozoide hacia adelante, permitiéndole orientarse y responder a las fluctuaciones de temperatura.
Los dispositivos de microfluídos diseñados para la separación de espermatozoides según la respuesta termotáctica, no resultaron ser lo suficientemente eficaces por si solos3. Una parte considerable de los espermatozoides parece necesitar de un estímulo adicional para una separación eficiente. Por este motivo algunos investigadores diseñaron dispositivos que combinan quimiotaxis con termotáxia, aplicando gradientes químicos con células del cúmulo o distintas moléculas, como la progesterona y/o acetilcolina. Para crear un gradiente de temperatura controlable y estable, diseñaron microcalentadores de óxido de indio-estaño (ITO) sobre el sustrato del dispositivo. Los resultados demostraron que los comportamientos de termotaxia y quimiotaxis no estaban interconectados3. Algunos espermatozoides respondían mejor al gradiente de temperatura, otros al gradiente de progesterona y un tercer grupo de espermatozoides respondían simultáneamente a ambos estímulos3.
En la Imagen 6. se muestra el diseño de un dispositivo con un canal único, una cámara de entrada y otra de recogida donde se añade el quimio-atractor (acetilcolina) para crear el gradiente de concentración por difusión en el medio. La diferencia de temperatura es generada por un microcalentador y controlada por un microsensor. En la imagen 7. se muestra la fotografía mediante cámara térmica del perfil térmico simulado en los electrodos superficiales del dispositivo y en el gráfico de la imagen 8. la distribución longitudinal (A, B) de la temperatura del microcalentador y microcanal tras el calentamiento. En la imagen 9. vemos los diagramas esquemáticos del dispositivo microfluídico de clasificación de esperma. Fig. 9 (a) Diagrama del chip de vidrio de migración espermática con el microcanal PDMS. Fig. 9 (b) Diagrama de los microcalentadores y microsensores ITO sobre el sustrato de vidrio.
Imagen 6. SLAS Technology 2018 23507-515DOI: (10.1177/2472630318783948)
Imágenes 7 y 8. SLAS Technology 2018 23507-515DOI: (10.1177/2472630318783948)
Imagen 9. SLAS Technology 2018 23507-515DOI: (10.1177/2472630318783948)
2.3. Dispositivos Inspirados en la Reotaxis
La reotaxis es el fenómeno por el cual los espermatozoides se reorientan en dirección contraria al flujo del fluido y nadan contra la corriente. En el TRF, el golpeteo de los cilios junto con el peristaltismo de los músculos del oviducto genera un flujo suave hacia el cuello uterino, que se considera un mecanismo guía en la migración espermática. Al entrar en esta vía, los espermatozoides reciben una señal de sus sensores que indica que han encontrado el camino para llegar al óvulo. Posteriormente, sufren un cambio sincronizado de trayectoria y comienzan a nadar contra la corriente con precisión para lograr la fertilización y a la vez evitar ser arrastrados fuera del TRF. El comportamiento reotáxico solo se da con éxito en los espermatozoides con mayor integridad del ADN3.
Existen gran variedad de dispositivos basados en la reotaxia para la separación de espermatozoides móviles. El principal inconveniente o ventaja de la reotaxis es que requiere flujos muy lentos y controlados, limitando el volumen de la muestra que podemos usar.
En las Imágenes 10, 11 y 12. Se muestra un dispositivo con un microcanal en forma de T. Se coloca una muestra de esperma licuada en el depósito de entrada, induciendo un flujo de difusión asistido por gravedad. Los espermatozoides móviles progresivos de la entrada y salida nadan contra corriente hacia el canal sellado, separándose de los restos y del esperma muerto que son arrastrados por el flujo creado hacia el depósito de salida. En la Imagen 7. se muestran los flujos de los espermatozoides sanos en verde y los muertos en rojo. En la Imagen 8. se representan las fuerzas y flujos que inciden sobre los espermatozoides. La Imagen 9. Muestra una representación tridimensional del dispositivo microfluídico en forma de T con entrada, salida y depósito sellado.
Imagen 10. https://link.springer.com/article/10.1007/s13534-022-00229-9/figures/1
Imagen 11. https://link.springer.com/article/10.1007/s13534-022-00229-9/figures/1
Imagen 12. https://link.springer.com/article/10.1007/s13534-022-00229-9/figures/1
El siguiente dispositivo que se muestra en la imagen 13, se trata de un chip progresivo de clasificación de espermatozoides (PSSC). El dispositivo presenta tres zonas funcionales (Figura 10C). El proceso de separación consiste en aplicar un flujo suficiente para estimular la reotaxis en los espermatozoides útiles que se mantienen nadando contra corriente y son retenidos en la zona de recogida, mientras el esperma muerto y restos celulares son arrastrados por el flujo hacia la trampa para su eliminación. Consta de ocho canales para la recogida de espermatozoides móviles, con una estructura triangular expansiva que condiciona que el flujo de entrada se ralentice gradualmente (Figura 10D). Como resultado, la mayoría de los espermatozoides móviles se dirigen a la zona de recogida a través del comportamiento de reotaxis del espermatozoide.
Imagen 13. iScience 2023 26DOI: (10.1016/j.isci.2023.107356)
2.4. Dispositivos Inspirados en la Thigmotaxis
Los espermatozoides se mantienen en los límites del TRF para reducir la resistencia, utilizan fuerzas hidrodinámicas para cambiar de dirección, ganan tracción a través de las interacciones superficiales y permanecen cerca de señales químicas que les guían hacia el óvulo. Estos comportamientos mejoran su eficiencia en la navegación dentro del TRF y aumentan la probabilidad de una fertilización exitosa.
La thigmotaxis implica que los espermatozoides buscan activamente y se adhieren a las superficies dentro del tracto reproductor. Este comportamiento se estimula por varios factores como el entorno viscoso, las fuerzas hidrodinámicas, las interacciones superficiales y las señales químicas.
Diferentes estudios han demostrado una alta correlación entre la integridad del ADN y el comportamiento de la Thigmotaxis, lo que ha inspirado al diseño de dispositivos basados en este mecanismo5. Para el diseño y desarrollo de estos dispositivos los investigadores tienen que crear un entorno favorable que estimule este comportamiento en los espermatozoides mediante fluidos viscosos y el diseño de diferentes obstáculos. Las muestras de semen se pueden usar en crudo sin procesamiento previo.
En la imagen 14. Se representa un dispositivo pasivo de selección microfluídica basada en la preferencia de los espermatozoides altamente móviles con alta integridad del ADN para girar esquinas y seguir límites en un dispositivo microfluídico. Se diseñaron tres chips microfluídicos similares pero distintos, cada chip con una configuración de canal específica para permitir la recolección de espermatozoides con preferencia para seguir los límites en el lado izquierdo (nadadores izquierdos), lado derecho (nadadores derechos), o para nadar recto (nadadores rectos). Para su uso, los dispositivos se llenaron con un medio estancado con la misma viscosidad que el fluido del TRF y se calentaron a 37 °C, imitando así el entorno in vivo y proporcionando condiciones favorables para la autopropulsión de los espermatozoides. Debido a la ausencia de flujo y a la viscosidad del entorno, solo los espermatozoides autopropulsados pudieron entrar en la compleja geometría del dispositivo, mientras que los espermatozoides muertos y los residuos permanecieron en la entrada.
Imagen 14. https://pubs.rsc.org/image/article/2016/lc/c6lc00490c/c6lc00490c-f1_hi-res.gif
El estudio reveló que los espermatozoides humanos que prefieren seguir los límites en los lados izquierdo o derecho presentan una integridad del ADN significativamente mayor (superior al 51%) en comparación con los nadadores rectos y un aumento significativo (superior al 67%) en comparación con los espermatozoides en semen crudo5.
En la Imagen 15, 16, 17 y 18. Se muestra el diseño del Simple Periodic ARray for Trapping And isolatioN (SPARTAN). Este sistema utiliza matrices de pilares para aislar del semen crudo espermatozoides altamente móviles y morfológicamente normales. Los espermatozoides con defectos morfológicos presentan características anormales de motilidad que les dificulta atravesar nadando los canales de manera efectiva. En la imagen 16, podemos ver los ejemplos de las distintas trayectorias que pueden adoptar los espermatozoides con morfología normal, y el avance progresivo que llevan, frente a los ejemplos de trayectorias erráticas de los espermatozoides con alteraciones anatómicas, que les dificultan un avance efectivo dentro del dispositivo y del TRF. En la imagen 17. tenemos un resumen en imágenes de todo el proceso hasta la selección final. En la imagen 18. se muestra una ampliación microscópica de las formas de aproximación de los diferentes espermatozoides a los obstáculos.
Imagen 15. Advanced Science, Volume: 5, Issue: 2, First published: 27 December 2017, DOI: (10.1002/advs.201700531)
Imagen 16. Advanced Science, Volume: 5, Issue: 2, First published: 27 December 2017, DOI: (10.1002/advs.201700531)
Imagen 17. Advanced Science, Volume: 5, Issue: 2, First published: 27 December 2017, DOI: (10.1002/advs.201700531)
Imagen 18. Advanced Science, Volume: 5, Issue: 2, First published: 27 December 2017, DOI: (10.1002/advs.201700531)
2.5 Dispositivos que combinan Reotaxis con Thigmotaxis
Los dispositivos de microfluidos no tienen por qué limitarse a estimular uno solo de estos comportamientos en los espermatozoides. Podemos diseñar dispositivos que combinen varios de estos principios incrementando la eficiencia del dispositivo. Así podemos imitar de una forma lo más fielmente posible, el complejo sistema de selección de espermatozoides que tiene lugar dentro del TRF, donde se combinan todos estos mecanismos simultáneamente.
Los dispositivos que se muestran a continuación se diseñaron para aislar espermatozoides móviles basándose en la combinación del comportamiento reotaxico y el seguimiento de límites (Thigmotaxis). En condiciones normales el flujo mucoso del TRF separa el esperma, atrapando los espermatozoides inmóviles. En cambio, los espermatozoides móviles emplean la reotaxis y el comportamiento de seguimiento de límites para nadar en sentido contrario al flujo y moverse hacia el ovocito.
En la Imagen 19. se muestra una ilustración de un dispositivo microfluídico que recrea los microsurcos y los flujos de fluidos que se encuentran en el TRF. Aquí, el puerto de siembra de las células está a un lado y la entrada de flujo al otro, conectados por canales con y sin microsurcos. En la imagen 20. se muestran los detalles del diseño del canal en el centro del dispositivo con seis canales para la experimentación paralela; G denota un canal con microsurcos en la superficie superior, y F denota un canal de control sin microsurcos. En la imagen 21. se muestra un dibujo 3D de como son los detalles dentro de un canal ranurado.
Imagen 19, 20 y 21. https://www.pnas.org/doi/full/10.1073/pnas.1500541112#fig01
En las imágenes 22 y 23 mostramos un dispositivo inspirado en las paredes del útero. En su zona frontal recrea una zona que estimula la reotaxis mediante un flujo que se crea con una bomba de jeringa conectada al sistema para que los espermatozoides puedan nadar contra la corriente y presenta obstáculos distribuidos a lo largo de las paredes para facilitar la entrada de espermatozoides sanos en los canales estrechos y curvados. Los espermatozoides que sigan su impulso de seguir limites alcanzaran los reservorios objetivo.
Imagen 22. https://www.nature.com/articles/s41598-023-28315-7/figures/1
Imagen 23. https://www.nature.com/articles/s41598-023-28315-7/figures/1
3. Dispositivos basados en mecanismos que no simulan los procesos dentro del TRF
Existen otros dispositivos microfluidicos que no se basan exclusivamente en los principios fisiológicos observados dentro del TRF, pero que ya venían usándose con éxito en otras investigaciones con muestras biológicas en el laboratorio.
3.1. Métodos basados en acusto-fluidica.
Las técnicas de separación acústica microfluídica presentan numerosas ventajas en el trabajo con muestras biológicas, incluyendo control preciso, biocompatibilidad y no invasividad.
La causa del aumento de motilidad tras la exposición a ondas acústicas no se comprende completamente, pero se cree que los principales factores que contribuyen a esta son la alteración de la actividad metabólica en el espermatozoide, esto provoca un aumento en la producción de ATP dentro del espermatozoide, lo que mejora la motilidad del espermatozoide.
En la imagen 24. Se muestra un dispositivo de selección espermática mediante técnicas de acustofluídos, en el que los espermatozoides móviles y morfológicamente normales se desplazan y separan de otras células y restos. El campo sonoro actúa de forma oblicua respecto al flujo para desviar los espermatozoides móviles y morfológicamente normales a través de las líneas de corriente del flujo. Las fuerzas acústicas superan eficazmente la resistencia viscosa para transferir lateralmente espermatozoides a lo largo del ancho del microcanal.
En la imagen 25. se muestra el uso de una plataforma acustofluídica para investigar los efectos de la exposición acústica sobre la motilidad espermática. El dispositivo consistía en un chip de ultrasonidos y una cámara microfluídica de polidimetilsiloxano (PDMS), dentro de la cual se introducía la muestra de esperma (Figura 25a). Se utilizó un par de transductores interdigitales (IDT) para generar ondas contrapropagantes a lo largo de un sustrato al excitarse un campo eléctrico de corriente alterna. Esta energía se acopla desde el sustrato en el fluido colocado sobre él, generando campos sonoros de alta frecuencia que exponen a las células espermáticas a una estimulación ultrasónica predefinida. La Figura 25b muestra las trayectorias de natación de los espermatozoides antes y después de la exposición a la estimulación ultrasónica, con el color de las trayectorias correspondiente a la velocidad media de natación de los espermatozoides (velocidad curvilínea media, VCL). Aunque el flujo generado por la exposición a ultrasonidos disminuye inmediatamente con la interrupción de la exposición a ultrasonidos, la velocidad de natación de los espermatozoides tras la exposición sigue siendo considerablemente superior a su velocidad previa a la exposición.
3.2. Métodos basados en la electricidad
La electroforesis y la dielectroforesis (DEP) son dos métodos ampliamente estudiados para la manipulación y separación de partículas y células en dispositivos microfluídicos. La electroforesis es la migración preferente de partículas cargadas en un campo eléctrico espacialmente uniforme en un fluido. Por el contrario, DEP utiliza un campo eléctrico no uniforme para ejercer fuerza sobre partículas dieléctricas. La partícula dieléctrica se polariza en el campo eléctrico y pueden experimentar fuerzas atractivas o repulsivas desiguales, resultando en un movimiento en la dirección de la fuerza predominante. Los factores que contribuyen a determinar la dirección de migración en DEP son las propiedades dieléctricas, el tamaño, la composición y, en el caso de las células, la composición de la membrana. En el caso de los espermatozoides puede resultar útil para distinguir entre células maduras y espermatogénicas en función de sus formas y polarizaciones eléctricas.
El dispositivo microfluídico que se muestra en las imágenes 26 y 27. utiliza un microcanal con estructuras cilíndricas aislantes, sobre las que se aplica un potencial eléctrico de corriente continua. Las células espermáticas se introdujeron en el microcanal y, dado el campo eléctrico no uniforme resultante, la fuerza dielectroforética actuó sobre las células. Las diferencias de forma entre los espermatozoides maduros, menos polarizables que el medio, y las células espermáticas, más polarizables que el medio, dan lugar a diferentes respuestas en la polarización, separando así a los dos grupos dentro del dispositivo. En la imagen 24. Se muestra el atrapamiento dielectroforético de espermatozoides y células maduras, la dirección del flujo es de izquierda a derecha. Fig.27 a) A un potencial aplicado de 800 V, solo los espermatozoides maduros quedan atrapados. Fig. 27.b) Con un potencial de 1000 V, los espermatozoides maduros y algunas células espermatogénicas quedan inmovilizadas. Fig. 27.c) A 1200 V hay un alto atrapamiento de ambos tipos de células, donde los espermatozoides maduros quedan atrapados más atrás.
Imagen 26 y 27. https://link.springer.com/article/10.1007/s00449-012-0838-6/figures/1 y /4
En las Imagenes 28 y 29 se muestra el esquema del chip microfluídico clasificando, contando y detectando espermatozoides: Fig.28.a) la muestra de esperma en la cámara de entrada-In 1, incluye espermatozoides móviles, espermatozoides inmóviles y restos celulares. El primer flujo laminar los conduce a la cámara de salida-Out 1. El segundo flujo laminar se genera a partir de la muestra del medio en la cámara de entrada-In 2 y permite que los espermatozoides móviles naden a través de la línea de corriente desde el primer flujo laminar hasta la cámara de salida-Out 2, mientras que los espermatozoides inmóviles permanecen en el primer flujo laminar. Después de aislar los espermatozoides móviles del esperma inmóvil en el flujo de fluido laminar, fluyeron a través del par de electrodos, como se muestra en la Fig.28.b). La medición de la impedancia, por tanto, dependía de las características del espermatozoide o partícula entre el par de electrodos. Los flujos de las dos corrientes en el microcanal no se mezclaron, lo que permitió que los espermatozoides nadaran a través de la línea principal hacia el 2º flujo, mientras que los espermatozoides inmóviles y los restos celulares permanecían en la línea principal. El mecanismo de clasificación del esperma móvil puede aplicarse fácilmente en función de la capacidad del esperma móvil para cruzar líneas de corriente en un flujo de fluido laminar.
Imagen 28. https://www.mdpi.com/2072-666X/10/10/647
Imagen 29. https://www.mdpi.com/2072-666X/10/10/647
4. Dispositivos que aúnan procesos dentro de las TRA
En la actualidad la mejor alternativa para lograr la fecundación exitosa en parejas con problemas de fertilidad por factor masculino severo es la ICSI. Se trata de una técnica de fertilización que implica la microinyección de un espermatozoide dentro del ovocito, sorteando las barreras naturales que presenta el ovocito frente a la fertilización. Para seleccionar el mejor espermatozoide el embriólogo está obligado a realizar diferentes técnicas de laboratorio que implican la manipulación del espermatozoide y que inevitablemente le exponen a riesgos adicionales como el estrés mecánico por centrifugación y daños en el ADN por la exposición a ROS. Los embarazos resultantes de la aplicación de ICSI se han asociado con hasta cuatro veces un aumento en la incidencia de anomalías cromosómicas, trastornos del espectro autista, discapacidades intelectuales y defectos congénitos en comparación con los embarazos derivados de la FIV convencional.
Aún no se ha podido determinar si estos riesgos están relacionados con los efectos de la subfertilidad subyacente masculina o femenina, con otros factores médicos presentes en las parejas candidatas a ICSI, o con el procedimiento de la ICSI en sí mismo.
Esto ha impulsado a los investigadores a desarrollar dispositivos de microfluídica que ayuden a seleccionar los espermatozoides candidatos a la fertilización a la vez que se coincuban con los ovocitos para que tenga lugar la FIV. El objetivo de estos dispositivos es potenciar los resultados de la FIV con muestras de esperma subóptimas, como alternativa a la ICSI para lograr la fertilización y sin provocar daños en el ovocito ni en el espermatozoide.
En las imágenes 30 y 31. Se muestra un dispositivo basado en DEP para realizar el proceso de FIV en un chip. (Fig.30.A) Enlace del sustrato de vidrio de poli-dimetilsiloxano (PDMS) con el chip de electrodo ITO capaz de generar el campo eléctrico. (Fig.30.B) El concepto del experimento es que los ovocitos y espermatozoides se cargan en un microcanal con caudal volumétrico y quedan atrapados por la fuerza dielectroforética positiva (p-DEP) entre las dos almohadillas de electrodos durante aproximadamente 1 minuto. La concentración local de esperma aumenta a 100 × 106 esperma-mL−1, independientemente de la concentración original de espermatozoides. La flecha blanca muestra la dirección del flujo. Al liberar la fuerza DEP los ovocitos y espermatozoides quedan atrapados en la microestructura detrás del microcanal para la FIV durante 1 hora. (Fig.30.C). Tras 4-10 horas se observó la aparición de un segundo cuerpo polar y dos pronúcleos que indicaban la fertilización exitosa7. Los resultados de las investigaciones con este dispositivo demostraron una tasa de fertilización proporcional a la concentración de esperma en el chip microfluídico DEP y el seguimiento del desarrollo embrionario indicó que no hubo daño a ovocitos ni espermatozoides tras la FIV7.
En las Imágenes 32 y 33. Se muestra otro diseño de un dispositivo microfluídico diseñado para FIV con una muestra con baja concentración de espermatozoides. El dispositivo se puede separar en cuatro secciones. (1) Área de atrapamiento: donde se utiliza una fuerza DEP positiva para manipular el ovocito y concentrar los espermatozoides en los electrodos ITO; (2) Generación de gotas: se utiliza un diseño de enfoque en flujo para generar microgotas de emulsión con ovocitos separados; (3) Área de clasificación: se utiliza una válvula neumática para clasificar microgotas con cigotos fertilizados; (4) Área de almacenamiento: Las microgotas con embriones formados por ovocitos y espermatozoides entraron en la zona de almacenamiento; los demás se separaron en un depósito de residuos.
Imagen 32. https://www.mdpi.com/2072-666X/9/3/135
Imagen 33. https://www.mdpi.com/2072-666X/9/3/135
5. Resultados
Hemos clasificado los chips de selección de microfluídicos en varios grupos principales: los dispositivos inspirados en los procesos de selección natural y los mecanismos de guía utilizados por los espermatozoides dentro del FRT y los dispositivos basados en otros principios físicos, como la acústica y la DEP.
Los dispositivos microfluídicos basados en quimiotaxis y termotaxia ofrecen un rendimiento adecuado en términos de motilidad y otros parámetros importantes del esperma seleccionado. Sin embargo, los dispositivos basados en la quimiotaxis requieren añadir reactivos especiales y un diseño cuidadoso de los canales para crear un gradiente del quimioatrayente al que sean sensibles los espermatozoides, dificultando así su integración en los procedimientos actuales. Otro inconveniente de los dispositivos que funcionan por quimiotaxis es que las muestras necesitan capacitarse previamente, ya que sólo los espermatozoides capacitados pueden responder a la atracción del quimioatrayente, y esto incrementa los tiempos de laboratorio para la selección de los espermatozoides y la exposición a ROS, así como el estrés mecánico producido por la centrifugación.
Los dispositivos inspirados en la termotaxia solo son percibidos por una fracción menor de los espermatozoides y, por tanto, no pueden utilizarse como mecanismos independientes para la separación del esperma deseado si no en combinación con otros estímulos y marcadores como la quimiotaxis o las diferencias en la carga eléctrica superficial de los espermatozoides maduros e inmaduros, para aumentar el número de espermatozoides maduros y viables seleccionados.
La reotaxia es capaz de separar esperma móvil de forma rápida, no usa marcadores adicionales y es eficaz, demostrando una mejora considerable en la integridad del ADN de los espermatozoides seleccionados con esta técnica. Depende únicamente de un flujo de fluido para funcionar, eliminando la necesidad de añadir reactivos e instrumentos específicos. El principal inconveniente de estos dispositivos puede considerarse también en una gran ventaja, y es que es un sistema de bajo rendimiento que requiere flujos muy lentos y controlados, limitando los volúmenes de la muestra de semen que podemos utilizar.
También se han intentado desarrollar dispositivos aprovechando el comportamiento de tigmotaxis del esperma para la separación de las poblaciones más maduras. Algunos de estos dispositivos demostraron resultados impresionantes en términos de motilidad e integridad del ADN. No requieren procesamiento previo de las muestras de semen empleadas y son procedimientos sencillos lo que hace que su integración en las TRA sea mucho más factible.
Por otro lado, los dispositivos microfluídicos basados en otros mecanismos físicos que no simulan los procesos dentro del TRF, pese a mostrar su utilidad en términos de selección de espermatozoides maduros, su rendimiento en términos de selección de la calidad del esperma clasificado no está a la altura de los dispositivos inspirados en mecanismos naturales.
Los dispositivos inspirados en la microfluídica han demostrado su utilidad no solo para la clasificación de esperma, algunas investigaciones han demostraron el potencial de la FIV en chip, integrando varias etapas de los procedimientos de TRA en un solo chip. Esta opción podría suponer una opción muy útil para el ahorro de recursos, ofreciendo a los pacientes menores costes de tratamiento por ciclo y, al mismo tiempo, aumentando la probabilidad de que la fecundación se acumule. Otra ventaja de estos dispositivos radica en la optimización de la FIV con muestras de espermatozoides subóptimas, suponiendo una alternativa a la realización de la ICSI.
6. Conclusiones
A pesar de la eficacia de los métodos actuales empleados en las TRA, estos métodos están lejos de ser ideales, ya que pueden causar daños añadidos a las células espermáticas.
Los espermatozoides seleccionados mediante estas técnicas tradicionales (Ej. swim up, gradientes de densidad, ...) pueden sufrir varios inconvenientes entre los que se incluyen: contaminación con espermatozoides poco móviles y células somáticas y daños en el ADN debido al procesamiento prolongado de múltiples pasos y a la centrifugación.
Estas limitaciones, especialmente la lesión iatrogénica por centrifugación, pueden inducir daño al ADN del esperma y conducir a un desarrollo deficiente del embrión aumentando el riesgo de aborto espontáneo después de la fertilización y/o afectando negativamente la salud de la descendencia.
Es preciso que la ciencia y la tecnología se unan para desarrollar sistemas de selección de espermatozoides que sean rápidos, económicos, fáciles de usar, accesibles y eficaces. Que a su vez puedan incorporarse fácilmente en las rutinas de las TRA actuales sin requerir inversión de capital ni cambios significativos en la infraestructura y que no contribuyan a encarecer los tratamientos.
Entre los requisitos que deben cumplir los nuevos dispositivos: biocompatibilidad, alto rendimiento, naturaleza no invasiva, automatización de los procesos, reducción del tiempo de procesamiento de las muestras de esperma, reducción del riesgo de contaminación bacteriana y viral, y daño limitado a las células espermáticas.
Las nuevas técnicas de microfluídica parecen cumplir ampliamente con estos requisitos y resultan una opción emergente y atractiva para la selección y análisis de espermatozoides dentro de las TRA.
Los conocimientos adquiridos con los diseños experimentales aquí mostrados pueden aplicarse para diseñar dispositivos comerciales que podamos aplicar en la práctica clínica, facilitando nuestra labor, provocando menor daño de los espermatozoides, optimizando resultados y abaratando costes en los procedimientos.
Los dispositivos de microfluidos no tienen por qué limitarse a estimular uno solo de estos comportamientos en los espermatozoides: Quimitaxis, Termotaxis, Reotaxis y Thigmotaxis. La capacidad de integrar todos estos principios en un solo dispositivo podría incrementar la eficiencia del dispositivo al reproducir más fielmente el complejo sistema de selección de espermatozoides que tiene lugar dentro del TRF, donde se combinan todos estos mecanismos simultáneamente.
7. Bibliografía
1. Jahangiri AR, Ziarati N, Dadkhah E, et al. Microfluidics: The future of sperm selection in assisted reproduction. Andrology. 2024; 12: 1236-1252.
2. Xiao S, Riordon J, Simchi M, Lagunov A, Hannam T, Jarvi K, Nosrati R, Sinton D. FertDish: microfluidic sperm selection-in-a-dish for intracytoplasmic sperm injection. Lab Chip. 2021 Feb 23;21(4):775-783. doi: 10.1039/d0lc00874e. PMID: 33507191.
3. Bouloorchi Tabalvandani M, Saeidpour Z, Habibi Z, Javadizadeh S, Firoozabadi SA, Badieirostami M. Microfluidics as an emerging paradigm for assisted reproductive technology: A sperm separation perspective. Biomed Microdevices. 2024 Apr 23;26(2):23. doi: 10.1007/s10544-024-00705-2. PMID: 38652182.
4. Ma J, Xie Q, Zhang Y, Xiao Q, Liu X, Qiao C, Tian Y. Advances in microfluidic technology for sperm screening and in vitro fertilization. Anal Bioanal Chem. 2024 Jul;416(16):3717-3735. doi: 10.1007/s00216-023-05120-9. Epub 2024 Jan 8. PMID: 38189916.
5. L. Eamer, M. Vollmer, R. Nosrati, M.C. San Gabriel, K. Zeidan, A. Zini, D. Sinton, Turning the corner in fertility: High DNA integrity of boundary-following sperm. Lab Chip 16(13), 2418–2422 (2016). https://doi.org/10.1039/c6lc00490c
6. J. Riordon, F. Tarlan, J.B. You, B. Zhang, P.J. Graham, T. Kong, Y. Wang, A. Lagunov, T. Hannam, K. Jarvi, D. Sinton, Two-dimensional planar swimming selects for high DNA integrity sperm. Lab Chip 19(13), 2161–2167 (2019). https://doi.org/10.1039/c9lc00209j
7. Huang HY, Kao WL, Wang YW, Yao DJ. Using a Dielectrophoretic Microfluidic Biochip Enhanced Fertilization of Mouse Embryo in Vitro. Micromachines (Basel). 2020 Jul 23;11(8):714. doi: 10.3390/mi11080714. PMID: 32717960; PMCID: PMC7464277.
8. H.Y. Huang, Y.L. Lai, D.J. Yao, Dielectrophoretic microfluidic device for in vitro fertilization. Micromachines 9(3) (2018). https://doi.org/10.3390/mi9030135
