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14 de diciembre de 2019

Desarrollo de un nuevo dispositivo para la selección espermática que emplea el uso de progesterona y distancia



            En los últimos años, el número de parejas que se someten a técnicas de fertilidad asistida para lograr la concepción se ha incrementado. Los motivos por los que acuden son diversos, pero se pueden agrupar en cuatro grupos: Infertilidad de origen femenina, por ejemplo, una endometriosis, es decir localización de tejido endometrial en un sitio diferente al útero como puede ser el ovario; infertilidad de origen masculina, paciente con incapacidad para eyacular; de origen mixto, tanto la mujer como el varón presentan alteraciones; o infertilidad sin causa aparente, en la cual los resultados no muestran alteraciones.


            En todos estos casos será necesario realizar la fertilización en forma artificial. Las técnicas destinadas para ello se las agrupan en baja complejidad o alta complejidad. El primer grupo corresponde a la inseminación intrauterina, que se realiza de forma rutinaria en el consultorio. En el segundo grupo será necesario pasar por quirófano para realizar la recuperación de los ovocitos de la mujer, efectuar la fertilización en el laboratorio y posteriormente llevar a cabo la transferencia de embriones.

            Independientemente de la técnica utilizada siempre será necesario preparar el gameto femenino, óvulo, y el gameto masculino, espermatozoide. A lo largo de los años se han ido perfeccionando las técnicas para acondicionar la muestra obtenida del varón, para poder emplearla en reproducción asistida.

            En la naturaleza, luego de que el varón eyacule en la vagina, los espermatozoides tendrán que viajar a lo largo del tracto reproductor hasta llegar a la trompa de Falopio, donde se producirá la fecundación. Los mismos serán guiados por una hormona femenina,  la progesterona, que tiene actividad de quimiotaxis, es decir  que es capaz de dirigir el recorrido de los espermatozoides. Durante este trayecto se llevará adelante un proceso que se conoce como capacitación, que tendrá por objetivo permitir que el espermatozoide sea capaz de fecundar el ovocito.

            También se sabe, que aquellos espermatozoides que presenten alteraciones tendrán menos posibilidades de realizar una fecundación exitosa y por lo tanto conseguir una gestación. Las alteraciones más relevantes son: morfología, quiere decir que la estructura de la célula no es la adecuada, por ejemplo, que tenga dos colas; motilidad, que es la capacidad para trasladarse; y también daño en el ADN, por lo tanto, el material genético se vería afectado.

            La muestra en el laboratorio debe ser procesada para imitar el proceso de capacitación y, a su vez, descartar aquellos que presenten alguna de las alteraciones antes mencionadas. Existen diversas alternativas para conseguir esto, como puede ser el gradiente de densidad, que consiste en recuperar aquellos espermatozoides con capacidad de atravesar un medio cada vez más denso; swim up, donde seleccionamos aquellos que son capaces de llegar a la superficie. También existen  técnicas más modernas como pueden ser: unión al ácido hialurónico (componente presente en los ovocitos), microfluídica (uso de canales microscópicos que simulan el recorrido del espermatozoide por el tracto genital femenino) y columnas de Anexina V (molécula que se une a los espermatozoides con daño en el ADN). Sin embargo, aún cuando  todas ellas persiguen el objetivo de recuperar espermatozoides capacitados e idealmente sin alteraciones, ninguna intenta emular lo que ocurre en la naturaleza.

            Aunque esto podría estar quedando en el pasado, ya que el grupo de investigación dirigido por Kun Li (U. de Zhejiang) ha diseñado un dispositivo que asemeja el tracto genital femenino. 




 Como se puede apreciar en la figura 1., el dispositivo es de un material plástico que no genera toxicidad y sus dimensiones son similares a las del tracto genital de la mujer.  Podemos observar un pocillo A, que imitaría a la vagina, dos pocillos F y G que corresponden a los ovarios y los canales que comunican dichos pocillos serían las trompas de Falopio y el resto el útero.

El dispositivo se carga con una mezcla de agar y quimioatrayentes, que simulan la progesterona. A continuación, en el pocillo A se coloca la muestra de semen, se la deja correr por un tiempo aproximado de 150 minutos hasta que alcanza los pocillos F y G. Luego, aquellos espermatozoides que hayan llegado a su destino serán utilizados para las técnicas de reproducción asistida. (Figura 2)


Hasta el momento las pruebas realizadas han sido alentadoras, porque se demostró que con el dispositivo mejora la selección espermática dado que los espermatozoides que llegan al final tienen mayor motilidad y son morfológicamente normales, a diferencia de las otras técnicas que actualmente se encuentran en uso de forma rutinaria. 

            También es importante destacar que no se incrementó el daño de ADN, ni se produjo una mayor cantidad de apoptosis, muerte celular programada; circunstancias que ponen de manifiesto que la técnica no sería dañina para la muestra procesada.

            Por último, es una técnica sencilla de realizar y de bajo costo, dado que los dispositivos son económicos de fabricar, con la ventaja adicional que no es necesario capacitar a los técnicos para que puedan utilizarlos. El inconveniente que presentan es que solo pueden ser empleados en aquellos varones que tengan una determinada concentración de espermatozoides en su eyaculado y que la movilidad de estos no sea nula, de lo contrario la muestra no podrá ser aprovechada.

            Si bien son necesarias mayores pruebas para demostrar su eficiencia, esperamos encontrar este dispositivo en los laboratorios de fertilidad asistida dentro de poco tiempo, para su uso rutinario en la selección de espermatozoides.


Bibliografía.  

Berguera, A., de la Orden Rodríguez, M., Martínez, J. V., Fernández, P. J. & Rubio, J. M. (19 de Julio de 2014). Evaluación de dos métodos de capacitación espermática (swim-up y gradientes) mediante el estudio de la morfología, madurez y fragmentación del DNA de los espermatozoides en muestras destinadas a IA. Revista Asebir. Recuperado de: https://revista.asebir.com/evaluacion-de-dos-metodos-de-capacitacion-espermatica-swim-up-y-gradientes-mediante-el-estudio-de-la-morfologia-madurez-y-fragmentacion-del-dna-de-los-espermatozoides-en-muestras-destinadas-a-ia/
                           
Li K., L R., Ni Y., Sun P., Liu Y., Zhang D & Huang H. (2018). Novel distanceprogesteronecombined selection approach improves human sperm quality. Journal of Translational Medicine 16:203. https://doi.org/10.1186/s12967-018-1575-7






Selección espermática: nuevo método mediante progesterona y distancia


Introducción

El 30℅ de las parejas que recurren a las técnicas de reproducción asistida para conseguir un embarazo presenta infertilidad masculina (Marzano et al., 2019). En la rutina de laboratorio el estudio de la fertilidad masculina se realiza mediante la evaluación de los parámetros establecidos por la Organización Mundial de la Salud (OMS) como son volumen de eyaculado, concentración espermática, morfología y motilidad (OMS, 2010) y según los valores obtenidos se recurre a la aplicación de fecundación in vitro convencional (FIV) o inyección espermática intracitoplasmática (ICSI). En este artículo vamos a realizar una revisión de las técnicas de selección espermática disponibles para seleccionar los espermatozoides con mejor calidad, desde las técnicas más convencionales como gradientes y swim-up hasta las más novedosas como microfluídica o el uso de progesterona.

Centrifugación por gradiente de densidad

Los gradientes de densidad consisten en la centrifugación del semen dispuesto en la superficie de soluciones con diferentes densidades, como por ejemplo 45% y 90% a 400g durante 20 minutos. De esta manera se seleccionarán los espermatozoides por su densidad y se recogerán del pellet resultante tras la centrifugación. Tanto esta técnica como Swim-up (explicada a continuación) son de uso rutinario en los laboratorios de reproducción pero presentan inconvenientes como el aumento de fragmentación en el ADN de los espermatozoides. En el estudio realizado por Muratori et al., 2019 se evaluó el porcentaje de daño en el ADN de los espermatozoides sometidos a Gradiente de densidad y swim-up, obteniendo como resultado un aumento del 60% y del 40% del daño de ADN en los espermatozoides.



Swim-up

Es una técnica que consistente en depositar la muestra de semen en el fondo del tubo y añadir en la parte superior medio de cultivo. Después se centrifuga a 250g durante 10 minutos y se elimina el sobrenadante. A continuación, se añade nuevo medio de cultivo y se incuba entre 20 minutos y 1 hora para que los espermatozoides depositados en el fondo puedan ascender. De esta manera, se recogen de la capa superficial los espermatozoides con mejor motilidad y morfología (Berguera et al., 2014; Marzano et al., 2019). Como se comentó anteriormente,  el swim-up es una técnica muy usada pero que aumenta la fragmentación del ADN en espermatozoides.




PICSI

Es una técnica basada en el uso de ácido hialurónico (HA) como método de selección espermática. El ácido hialurónico es un glicosaminoglicano que se encuentra presente tanto en el moco cervical como en las células del cúmulo. Además, cabe destacar que los espermatozoides presentan receptores para ácido hialurónico por lo que aquellos que se unen a HA se encontrarán en estado de madurez, lo que permitirá que sean usados en las técnicas de TRA.  Se han realizado varios estudios sobre la efectividad de esta técnica, entre ellos el de Kim et al., 2019, donde se estudian 152 parejas con infertilidad masculina. En este estudio la infertilidad se debía a teratozoospermia con menos de 1% de espermatozoides con formas normales. De las 152 parejas, 77 fueron sometidas a PICSI, es decir, selección de espermatozoides mediante HA y realización de ICSI. Los resultados de este estudio muestran un aumento de las tasas de fecundación y de embriones de buena calidad en comparación a la selección a microscopio de solo por morfología y motilidad y realización posterior de ICSI.



Microfluídica


El método de microfluídica está basado en el recorrido que deben realizar los espermatozoides por el tracto genital femenino. De esta forma, se ha desarrollado un chip compuesto de microcanales para seleccionar aquellos espermatozoides que presentan mayor motilidad y menor porcentaje de anomalías, como fragmentación del ADN. (Berguera et al., 2014). Los métodos de selección espermática mediante microfluídica se pueden dividir según usen mecanismos activos o pasivos de selección. Los métodos activos están basados en el uso de gradientes químicos, electroforesis o flujos, mientras que los métodos pasivos seleccionan los espermatozoides en base a su motilidad únicamente. Cabe destacar que esta técnica es no invasiva y muestra mejores resultados en la vitalidad, motilidad y morfología en comparación a las técnicas de centrifugación y swim-up. (Nosrati et al., 2017).



Columnas de Anexina V (MACS)

MACS es una técnica que consistente en la incubación de los espermatozoides con microperlas funcionalizadas con Anexina V. Durante esta incubación aquellos espermatozoides que hayan externalizado fosfatidilserina en la hemicapa externa de la membrana debido al inicio del proceso de apoptosis quedarán unidos a estas microperlas. Tras la incubación la muestra pasará por una columna con propiedades magnéticas donde los espermatozoides unidos a las microperlas quedarán retenidos. De esta manera solo los espermatozoides no unidos a la columna se usarán para fertilizar (Berguera et al., 2014).



Progesterona-distancia

Lin et al.,2019 han desarrollado un dispositivo basado en la distancia que deben recorrer los espermatozoides desde la vagina hasta las trompas de Falopio y en la quimiotaxis que sufren estos mediante la progesterona secretada por las células del cúmulo durante el proceso de selección natural. La quimiotaxis consiste en que los espermatozoides se mueven en la dirección de un gradiente formado por una sustancia química o péptido, y solo los espermatozoides capacitados responden a esta. Por lo tanto, los espermatozoides seleccionados por quimiotaxis están capacitados y son de mejor calidad.

El dispositivo desarrollado está formado por un cámara que simula la vagina (A) y dos cámaras que simulan los ovarios (F y G). Los canales que comunican F y G simulan las trompas de Falopio, quedando en el centro una cavidad que hace las veces de útero. En el estudio realizado por Lin et al., 2019 se dispusieron las mezclas de agar y quimioatrayentes (para simular el gradiente de progesterona) de la siguiente forma: se establecieron tres surcos con agar entre el útero (C) y uno de los ovarios (F) (D1, D2 y D3) y otros tres surcos entre C (útero) y G (ovario) (E1, E2 y E3). Se depositó una solución control formada por 2% de agar y DMSO en el surco D1 y una solución de 2% agar con 0.3 M de progesterona en E1. Tras depositar semen seleccionado mediante gradiente de densidad en la cámara A se les proporcionó 150 minutos para nadar y llegar a las cámaras más alejadas. Tras este tiempo se hicieron las evaluaciones de morfología, dispersión de cromatina y apoptosis. Tras la realización del experimento solo se encontraron diferencias significativas entre la morfología de los espermatozoides del punto E1 y D2, teniendo los del surco E1 mejor morfología.



Discusión

Cómo se ha descrito a lo largo de este artículo, existen numerosas técnicas para la selección espermática. Las más usadas son la centrifugación por gradiente de densidad y swim-up. Estas técnicas son poco costas y rápidas de llevar a cabo, pero presentan el inconveniente de que producen daños en el ADN espermático, tal y como recogen los trabajos realizados por De Martin et al., 2017 y Muratori et al., 2019. Debido a este inconveniente, se han desarrollado nuevas técnicas para poder seleccionar los espermatozoides más viables, motiles y con mejor morfología. Son muchas las técnicas desarrolladas como el uso de columnas de Anexina V, microfluídica y PICSI, de las cuales se han realizado diferentes estudios con resultados prometedores. En cuanto a la PICSI Nasr-Esfahani el al., 2008 informaron que los espermatozoides seleccionados por esta técnica mostraron menos deficiencia de protamina, fragmentación de ADN y morfología anormal en comparación con las técnicas convencionales de selección espermática. Por otro lado, en el estudio realizado por Troya & Zorrilla, 2015 se demostró que, en parejas infértiles, la selección mediante el uso de columnas de Anexina V limita la cantidad de esperma seleccionado que presenta ADN dañado, lo que condujo a mejores tasas de embarazo clínico en comparación con ICSI convencional y PICSI. Una de las técnicas más novedosas de selección espermática es la microfluídica. Esta técnica se presenta como una potente alternativa a swim-up y a la centrifugación por gradiente densidad, tal como se explica en los trabajos de Shirota et al., 2016 y Nosrati et al, 2017. Finalmente, cabe destacar la creación de una nueva técnica de selección espermática basada en el uso de un gradiente quimiotáctico de progesterona y en imitación de la distancia que deben recorrer los espermatozoides por el tracto genital femenino. Con esta técnica, desarrollada por Lin et al, 2018 se consigue seleccionar espermatozoides de mejor morfología y con menos fragmentación del ADN, por lo que se presenta como una muy buena técnica para la selección espermática, pero aún deben realizarse más estudios con mayor número de pacientes y diversas causas de infertilidad para comprobar su verdadera eficiencia.

Podemos concluir que, pese al gran número de técnicas desarrolladas para la selección espermática, aún no se ha desarrollado aquella que destaque en sus resultados por encima de las demás, todas poseen sus ventajas e inconvenientes, siendo algunas de ellas demasiado recientes como para poder obtener alguna conclusión en firme sobre su efectividad en clínica.

Bibliografia

Berguera, A., de la Orden Rodríguez, M., Martínez, J. V., Fernández, P. J. & Rubio, J. M. (2014). Evaluación de dos métodos de capacitación espermática (swim-up y gradientes) mediante el estudio de la morfología, madurez y fragmentación del DNA de los espermatozoides en muestras destinadas a IA. Revista Asebir. Recuperado de: https://revista.asebir.com/evaluacion-de-dos-metodos-de-capacitacion-espermatica-swim- upy-gradientes-mediante-el-estudio-de-la-morfologia-madurez-y-fragmentacion-del-dna-de-losespermatozoides-en-muestras-destinadas-a-ia/


Kim, S.J., Kim, H., Kim, T.H., Jeong, J., Lee, W.S. & Lyu, S.W. (2019). Effect of sperm selection using hyaluronan on fertilization and quality of cleavage-stage embryos in intracytoplasmic sperm injection (ICSI) cycles of couples with severe teratozoospermia. Gynecological Endocrinology. https://doi.org/10.1080/09513590.2019.1681960

Lin K., L R., Ni Y., Sun P., Liu Y., Zhang D & Huang H. (2018). Novel distanceprogesteronecombined selection approach improves human sperm quality. Journal of Translational Medicine 16:203. https://doi.org/10.1186/s12967-018-1575-7

Marzano, G., Chiriacò M.S., Primiceri, E., Dell’Alquila, M.E., Ramalho-Santos,J., Zara, V., Ferramosca,A & Mauriccio, G. (2019). Sperm selection in assisted reproduction: A review of established methods and cutting-edge possibilities. Biotechnology Advances. https://doi.org/10.1016/j.biotechadv.2019.107498

Muratori M, Tarozzi N, Carpentiero F, Danti S, Perrone FM, Cambi M, Casini A, Azzari C, Boni L, Maggi M, Borini A & Baldi E. (2019). Sperm selection with density gradient centrifugation and swim up: efect on DNA fragmentation in viable spermatozoa. Scientific Reports 9, 7492. https://doi.org/10.1038/s41598-019-43981-2

Nasr-Esfahani, M.H., Razavi, S., Vahdati, A.A., Fathi & F. Tavalaee, M. (2008). Evaluation of sperm selection procedure based on hyaluronic acid binding ability on ICSI outcome. J Assist Reprod Genet, 25(5), 197-203. https://doi.org/10.1007/s10815-008-9223-4

Nosrati, R., Graham, P.J., Zhang, B., Riordon, J., Lagunov, A., Hannam, T.G., Escobedo, C., Jarvi, K & Sinton, D. (2017). Microfluidics for sperm analysis and selection. Nature Reviews Urology, 14(12), 707-730. https://doi.org/10.1038/nrurol.2017.175

Troya, J. & Zorrilla, I. (2015). Annexin V-MACS in infertile couples as method for separation of sperm without DNA fragmentation. JBRA Assist Reprod, 19(2), 9-66. https://doi.org/10.5935/1518-0557.20150015

Shirota, K., Yotsumoto, F., Itoh, H., Obama, H., Hidaka, N., Nakajima, K. & Miyamoto, S. (2016). Separation efficiency of a microfluidic sperm sorter to minimize sperm DNA damage. Fertiliy and Sterility, 102(2), 315-321. https://doi.org/10.1016/j.fertnstert.2015.10.023.