Recuperación espermática en hombres con azoospermia

INTRODUCCIÓN

La azoospermia es definida como la ausencia de espermatozoides en el fluido seminal, que puede ser debida a una inadecuada estimulación hormonal (hipogonadismo hipogonadotrópico), anormalidades espermáticas u obstrucción. Aproximadamente el 10-15% de la infertilidad por factor masculino se ha atribuido a azoospermia.

Una vez obtenido el diagnóstico de azoospermia mediante la realización de entre 2 y 3 seminogramas, su evaluación debe dirigirse a determinar si es causada por una pérdida de espermatogénesis o por una obstrucción ductal. Las causas incluyen: obstrucción de los vasos deferentes, tamaño testicular, FSH sérica (Figura 1).

Figura 1. Algoritmo para la evaluación del paciente con azoospermia, (tomada de Urbina. Lerner Biber. Fertilidad y reproducción asistida. Primera edición. Caracas: Editorial Médica Panamericana; 2008).

Causas de azoospermia obstructiva: orquidopexia, cirugía inguinal, escrotal o retroperitoneal, vasectomía, enfermedades de transmisión sexual, tuberculosis y procesos infecciosos, entre otras. También es interesante investigar en la familia si hay antecedentes de fibrosis quística, factor muy importante en la obstrucción.

La azoospermia no obstructiva es el resultado de la producción de esperma gravemente deteriorado o inexistente: hipogonadismo hipogonadotrópico, anormalidades espermáticas.

Objetivos de la recuperación espermática:

• Obtener la mejor calidad de espermatozoides posible.
• Recuperar un adecuado número de espermatozoides tanto para uso inmediato como para criopreservación.
• Minimizar el daño al tracto reproductivo de modo que no amenace futuros intentos de recuperación espermática o reconstrucción quirúrgica.

Requerimientos:

El personal del laboratorio de reproducción asistida debe tener experiencia en ICSI y debe estar presente en el lugar de la recuperación espermática.

Para realizar métodos de recuperación espermática abierta se debe contar con instrumental microquirúrgico; mientras que para la recuperación espermática percutánea, debe contarse con dispositivos de presión negativa que puedan acoplarse a agujas finas, así como también disponer de instrumental (pistolas) de biopsia percutánea

Se debe tener disponible un medio de incubación o cultivo con nutrientes espermáticos como HAM’S F-10.

Por normas internacionales para la criopreservación espermática se solicitarán previamente exámenes para descartar Hepatitis B, Hepatitis C, VIH, HTLV 1 y 2, Sífilis, CMV (Citomegalovirus), Neisseria gonorrhoeae y Chlamydia trachomatis.

Debe tenerse un microscopio de laboratorio en el sitio donde se realice la recuperación espermática para determinar el número y la movilidad de los espermatozoides del esperma obtenido. De igual modo, las técnicas de recuperación espermática abierta requieren de la disponibilidad de un microscopio quirúrgico.

Métodos:

Tradicionalmente se realizaba por biopsia testicular. Este método convencional de extracción de esperma por vía quirúrgica general, biopsia convencional, ofrece la mejor oportunidad de recuperar espermatozoides, independientemente de la etiología de la azoospermia. La biopsia abierta también permite la escisión de una masa de tejido más grande, permitiendo el acceso a un mayor número de espermatozoides disponibles para la congelación. El principal inconveniente de la biopsia abierta, desde el punto de vista del paciente, es el tamaño de la herida y el tiempo de curación en comparación con otras formas de aspiración, a saber, la aspiración con aguja. Por eso, ahora, se suelen utilizar más otros métodos:

• MESA: Aspiración Espermática Epididimaria Micro-quirúrgica.
• PESA: Aspiración Espermática Epididimaria Percutánea.
• TESE: Extracción Espermática Testicular (sería la biopsia abierta).
• TESA: Aspiración Espermática Testicular (percutánea).
• TEFNA: Aspiración Testicular Epididimaria con Aguja Fina (también percutánea).

MESA

(Urbina. Lerner Biber. Fertilidad y reproducción asistida. Primera edición. Caracas: Editorial Médica Panamericana; 2008). Esta técnica implica la exposición de los túbulos epididimarios, la apertura microquirúrgica del túbulo y la aspiración del fluido tubular dentro de una jeringa de 1 cm3 que contiene medio de incubación espermática.

Para esta aspiración puede usarse un catéter (angiocatéter) de pequeña talla (22-27 gauge) unido a una jeringa para desarrollar la aspiración. Es útil deprimir el área abierta del túbulo epididimario para crear una apertura a partir de la cual el fluido epididimario pueda ser aspirado. Es necesario administrar al sujeto anestesia general. Si hay espermatozoides móviles que se encuentren en el primer sitio, la maniobra se repite, hasta recuperar repetidas muestras. Típicamente, se recuperan sólo unos pocos microlitros de fluido porque las muestras de espermatozoides del epidídimo están altamente concentradas en el fluido del epidídimo (aproximadamente 1 × 10 ⁶ espermatozoides / mL).

Los espermatozoides epididimarios obtenidos por este método sólo son útiles para ICSI.

Los biólogos o demás personal cualificado, pueden congelar los espermatozoides en varios tubos o pajuelas, para poder ser utilizados en varios intentos de ICSI, y así disminuir la necesidad de realizar otra MESA, ya que se suelen obtener una gran cantidad de espermatozoides.

Es la técnica de elección para algunos cirujanos para recuperar quirúrgicamente espermatozoides debido a la alta concentración y la calidad de los espermatozoides obtenidos en comparación con la obtención de espermatozoides testiculares, especialmente en pacientes con obstrucción del epidídimo irreparable. Los espermatozoides del epidídimo son maduros y progresivamente móviles, y aspirados del epidídimo son mucho más limpios y desprovistos de los restos celulares que se ven en las preparaciones de espermatozoides testiculares. La motilidad de los espermatozoides del epidídimo hace que la selección de espermatozoides durante la ICSI sea más fácil sin la introducción de medidas adicionales (como el tratamiento con agentes que mejoran la motilidad), a diferencia de que estas medidas adicionales pueden ser necesarias para identificar gametos viables si se utilizan espermatozoides testiculares. En un estudio comparativo de las dos técnicas de recuperación de espermatozoides del epidídimo (PESA y MESA), la tasa de recuperación de espermatozoides por PESA resultó ser del 61%, mientras que por MESA resultó ser del 93%, por lo que se concluyó con que con la técnica MESA el éxito era mayor.

Aunque, por otros estudios, se ve que es posible que al realizar MESA puedan encontrarse espermatozoides con una movilidad disminuida o ausente, por lo que puede ser necesaria la obtención de fluido tubular epididimario de niveles más altos, o incluso, de conductos deferentes para así obtener espermatozoides móviles del epidídimo obstruido. La disección es, entonces, realizada en el extremo caudal del epidídimo y llevada, proximalmente, hasta que se localicen espermatozoides móviles. Los biólogos deben informar al cirujano cuando haya sido obtenido un número suficiente de espermatozoides.

Si hay disparidad en el tamaño de los testículos, el procedimiento se desarrolla en el testículo más grande; aunque, en ocasiones, es necesario realizarlo bilateralmente y así obtener espermatozoides para criopreservación en suficientes alícuotas para futura ICSI (idealmente cada alícuota debe contener de 250.000 a 500.000 espermatozoides móviles).

Al finalizar el procedimiento, algunos cirujanos cierran cada incisión en el túbulo epididimario; mientras que otros, simplemente, cauterizan cada incisión para sellar la abertura.

PESA

(Urbina. Lerner Biber. Fertilidad y reproducción asistida. Primera edición. Caracas: Editorial Médica Panamericana; 2008). Esta técnica se lleva a cabo mediante una aguja tipo mariposa de 21 a 22 gauge, la cual puede unirse a una jeringa de tuberculina de 1 cm3 o acoplarse a una de mayor capacidad (25 cm3) montada en un dispositivo que permite crear presión negativa de manera sostenida.

A diferencia de MESA, donde el cirujano es capaz de visualizar los túbulos expuestos del epidídimo, PESA es un procedimiento ciego. De nuevo, si hay espermatozoides móviles presentes en el primer sitio, el cirujano extraerá repetidamente muestras.

La aguja es insertada en el epidídimo y se aspira hasta ver la aparición de una columna o gotas de fluido epididimario, entonces se sujeta el tubo con el fluido extraído y la jeringa antes de remover la aguja. Este procedimiento con técnicas de reproducción asistida obtiene tasas de embarazo equivalentes a aquéllas obtenidas usando recuperación espermática de manera micro-quirúrgica o por eyaculación. Es importante tener presente que puede producirse un daño irreversible del epidídimo, lo que impediría una futura reconstrucción si ésta fuese deseada. En esta técnica se emplea anestesia local.

PESA puede ser una buena opción para los pacientes con obstrucción ductal distal al epidídimo.

TESA

(Urbina. Lerner Biber. Fertilidad y reproducción asistida. Primera edición. Caracas: Editorial Médica Panamericana; 2008). Para los pacientes con azoospermia obstructiva en los que los espermatozoides no se pueden encontrar en el epidídimo, siempre es posible encontrar espermatozoides en el testículo.

Puede ser llevada a cabo con los materiales de la PESA. También se utiliza anestesia local. Una vez introducida la aguja en el testículo y creada la presión negativa, se mueve la aguja hacia dentro y hacia fuera, sin ser extraída y en la misma dirección, múltiples veces. Antes de remover la aguja, la presión negativa es eliminada lentamente para prevenir el aspirado de túbulos. Después de ser retirada, se separa de la jeringa, se aspira aire en ésta (de 5 a 10 cm3) y se conecta nuevamente, usando el aire para pasar el contenido de la aguja dentro del medio de incubación espermática.

Un método alternativo a este es llevar a cabo la TESA mediante una aguja de 18 o 20 gauge de biopsia, montada en una pistola para tal fin, de las cuales existen varias en el mercado. Una vez finalizado el procedimiento, debe realizarse presión sobre el sitio de punción durante 1 ó 2 minutos para garantizar la hemostasia.

Belker y Schrepferman han encontrado espermatozoides testiculares viables en un 75% de pacientes con azoospermia obstructiva tratados con TESA, por eso sus tasas de embarazo resultaron relativamente altas. En sus primeros 103 casos de TESA con ICSI lograron una tasa de embarazos clínicos del 30% y una de embarazos a término del 25%. Más recientemente, muchos centros de fertilidad han reportado tasas de embarazos clínicos del 40% al 55%, equivalentes a las logradas con esperma eyaculado normalmente.

TESE

(Urbina. Lerner Biber. Fertilidad y reproducción asistida. Primera edición. Caracas: Editorial Médica Panamericana; 2008). Es una opción disponible para hombres con azoospermia no obstructiva que desean tener un hijo genético, consiste en la recuperación espermática del tejido testicular por alguna forma de biopsia mediante cirugía abierta. Esta técnica requiere anestesia general.

Puede realizarse por medio de microdisección o mediante la obtención de tejido testicular; al practicar una escisión de éste con unas tijeras, una vez realizada la apertura de la albugínea testicular. Con la microdisección, una mínima cantidad de tejido testicular es escindido y puede ser recuperada una cantidad suficiente de espermatozoides. Mediante la obtención de tejido testicular, al realizarse una magnificación óptica pueden identificarse las zonas avasculares del testículo para ocasionar el menor daño posible.

En general, el número de espermatozoides obtenidos por biopsia abierta (TESE) es significativamente mayor que el obtenido por aspiración con aguja.

La biopsia pretratamiento ha dejado de ser desarrollada en muchos centros, para llevarse a cabo en el momento de la recuperación espermática, ya sea previo a un ciclo de FIV con criopreservación o dentro de un ciclo al tiempo de la obtención de ovocitos. Los hallazgos de la biopsia diagnóstica son útiles para evaluar la probabilidad de TESE exitosa, pero no son garantía de que serán encontrados espermatozoides el día de FIV. Se ha reportado que de un 20% a un 35% de los hombres con azoospermia no obstructiva tienen espermatozoides en eyaculados previos a TESE.

El patrón espermático más avanzado (no el predominante) hallado en la biopsia testicular parece estar relacionado con los resultados de recuperación espermática. Así, se tiene  que se pueden encontrar espermatozoides hasta en un 81% de los casos de hipoespermatogénesis; en un 42% de aquéllos con arresto de la maduración y en un 24% de los pacientes con patrón histológico de sólo células de Sertoli.

Schlegel y colaboradores, reportaron recuperación espermática en pacientes con azoospermia no obstructiva: en el 95% de los pacientes con hipoespermatogénesis (documentada por previa biopsia testicular), en el 90% de los que tienen arresto de maduración, en el 30% de los que tienen sólo células de Sertoli, en el 75% de los hombres con azoospermia obstructiva debido a criptorquidia, que se someten a TESE, y en el 70% de los hombres con Síndrome de Klinefelter que se someten a Micro-TESE.

Schlegel encuentra que la microdisección mejora las tasas de recuperación del 45% (10/22) al 63% (17/27) en una serie secuencial de intentos de TESE. La muestra por microdisección produjo 160.000 espermatozoides  en 9,4 g de tejido; mientras que solamente 64.000 espermatozoides fueron encontrados en muestras obtenidas por biopsias convencionales, con un promedio de 720 mg  de tejido escindido.

La TESE no está exenta de complicaciones y así Schlegel y Sue, reportaron daño en el flujo sanguíneo testicular por desvascularización después de múltiples biopsias. Por lo que proponen, entonces, el método microquirúrgico de TESE (Micro-TESE), con el que se obtiene un número abundante de espermatozoides a partir de una mínima cantidad de tejido testicular en hombres con azoospermia no obstructiva.

En este procedimiento, los túbulos seminíferos dilatados entre túbulos seminíferos colapsados son los que probablemente contienen espermatozoides. Aunque con Micro-TESE la recuperación de espermatozoides en azoospermia no obstructiva es menor que con múltiples biopsias, la microdisección produce una mayor concentración de espermatozoides, con menos tejido removido.

Las ventajas de la micro-TESE, además de las tasas de recuperación de espermatozoides superiores, incluyen la prevención de complicaciones como hematomas, fibrosis, y la producción de andrógenos alterada. 

Un método alternativo descrito por Turek y colaboradores es el mapeo del testículo por múltiples aspiraciones con aguja fina, que permite determinar los mejores sitios para, más tarde, desarrollar TESE o TESA; así el paciente confortablemente tiene acceso a FIV o ICSI sin la incertidumbre y sin el uso de tejido testicular criopreservado, lo cual puede afectar a la tasa de embarazo.

Los túbulos seminíferos logrados por TESE o TESA pueden ser sometidos a disección mecánica para la obtención de espermatozoides y colocarlos en el medio de incubación de espermatozoides. En muchos centros de fertilidad, primero se diseca el tejido de los túbulos entre 2 pequeñas agujas (26 ó 27 gauge), y si no se observan espermatozoides se procede a hacer una remoción enzimática del tejido. Si sólo se obtuvieron espermatozoides no móviles, éstos se pueden incubar con pentoxifilina o puede ser necesario hacer un test de shock hipoosmótico para seleccionar los espermatozoides viables que serán inyectados en cada ovocito.

TEFNA

(Urbina. Lerner Biber. Fertilidad y reproducción asistida. Primera edición. Caracas: Editorial Médica Panamericana; 2008). Este otro procedimiento puede utilizarse tanto en la azoospermia obstructiva como en la azoospermia no obstructiva, en el cual se combina tanto la aspiración epididimaria como testicular con aguja fina; para ello, se utiliza una aguja tipo mariposa número 23 conectada a una jeringa de 20 cm3, acoplada a un sistema de succión manual como el anteriormente descrito. La aguja es introducida dentro de la cabeza del epidídimo y se aplica succión. Cuando el fluido epidimario deja de acumularse en el tubo, la aguja es retirada y el aspirado vertido en el medio de incubación de espermatozoides. Se utiliza anestesia local para aliviar las molestias que se ocasionarían en el procedimiento al sujeto.

Esta técnica parece ser eficiente, fácil de aprender, permite al operador la posibilidad de llegar a varios sitios intratesticulares, segura y bien tolerada por todos los pacientes, y podría llegar a considerarse la primera opción siempre que la recuperación de espermatozoides se intente en pacientes con azoospermia no obstructiva, según el estudio de Aby Lewin y colaboradores. Además, aumenta la posibilidad de recuperación de espermatozoides para ICSI, casi sin reducción en el volumen testicular.

Según el estudio de Bhushan y colaboradores, múltiples aspiraciones con aguja fina testiculares se han intentado en los hombres con azoospermia no obstructiva con éxito variable. El éxito de la recuperación de espermatozoides por TEFNA, según este estudio, depende de la etiología y la gravedad de la causa subyacente de la azoospermia. En un estudio prospectivo que compara la eficacia de múltiples biopsias con aguja con la extirpación testicular abierta, los espermatozoides se recuperaron en sólo el 14% de los pacientes con azoospermia no obstructiva de múltiples aspiraciones de aguja, y en el 63% de los pacientes después de la biopsia con escisión abierta. De este estudio se obtiene que el orden de encontrar espermatozoides de mayor a menor probabilidad en azoospermia no obstructiva es: Micro-TESE, TESE, TEFNA, TESA.

CONCLUSIONES

Las ventajas de las técnicas de recuperación espermática percutáneas (PESA, TESA, TEFNA) es que pueden ser desarrolladas con anestesia local, lo que minimiza morbilidad, y al mismo tiempo, costes. La ventaja de MESA es que la cantidad de espermatozoides que puede ser obtenida es mayor, esto permite la criopreservación de alícuotas extras para posibles futuros ciclos de ICSI.

La TESA puede ser utilizada para obtener espermatozoides testiculares en hombres con azoospermia obstructiva; mientras que la TESE puede ser necesaria para obtener espermatozoides testiculares en hombres con azoospermia no obstructiva, debido a que éstos tienen pocos espermatozoides.

Las posibilidades de recuperación de espermatozoides, y de lograr un nacimiento vivo por ICSI, se incrementan en parejas cuyo sujeto masculino presenta azoospermia obstructiva, en lugar de azoospermia no obstructiva.

Para la obtención de espermatozoides testiculares en hombres con azooospermia no obstructiva, se requiere que el personal del laboratorio de fertilidad sea adecuado y dedicado, ya que el tejido testicular tiene méritos para ser examinado en mayor proyección del tiempo, incluso horas y días después de su extracción en una incubación adecuada, en busca de espermatozoides.

El cirujano debe informar a las parejas de las ventajas y desventajas de cada una de las técnicas de recuperación espermática, así como de la posibilidad de criopreservación en un ciclo previo o en el día de la obtención de los ovocitos. Por último, debe tener la disponibilidad de un lugar de recuperación espermática en un laboratorio apropiado: con materiales, equipos y biólogos, u otro personal cualificado, altamente capacitados, además de estar familiarizado con las preferencias de éstos con respecto al uso de espermatozoides epididimarios o  testiculares, criopreservados o frescos.

Bibliografía:

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5. Aby Lewin. Benjamin Reubinoff. Anat Porat-Katz. David Weiss. Vered Eisenberg. Revital Arbel. Hagar Barel. Anat Safran. Testicular fine needle aspiration: the alternative method for sperm retrieval in non-obstructive azoospermia. Hum. Reprod. (1999) 14 (7):1785-1790. Doi: 10.1093/humrep/14.7.1785.

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15. Safran A. Reubinoff BE. Porat-Katz A. Schenker IG. Lewin A. Assisted reproduction for the treatment of azoospermia. Hum. Reprod. 1998; 13 (Supl 4): 47-60.

Autora:

         María Jesús Nieto García.

Análisis Funcional del Espermatozoide.

Máster Universitario en Biología y Tecnología de la Reproducción 2015-2016, Universidad de Oviedo.

ANÁLISIS SEMINAL 

EQUINO Y BOVINO

El análisis seminal tiene como objetivos predecir la fertilidad y capacidad fecundante del futuro semental y evaluar el semen durante los procesos de criopreservación.

ANÁLISIS SEMINAL BÁSICO:

El método más empleado en la recogida de semen para estas especies es la vagina artificial (coito ficticio), la cual permite obtener una muestra de eyaculado similar a la de la monta natural (condiciones higiénicas).

Volumen:

Se registra el volumen de semen filtrado, libre de gel (equino). El volumen oscila entre 20-150 ml (equino), y 5-8 ml (bovino). Existen importantes variaciones en función del individuo, raza, régimen sexual, estación del año, método de recogida, etc.[2]

Color:

Varía desde blanco acuoso a crema en función de la concentración espermática. Coloraciones anormales indicarían contaminaciones: orina, sangre, etc.[1]

pH:

Evaluación inmediatamente después de la recogida seminal (pHmetro/tiras de pH). Entre 7,2-7,6 en equino, y 6,4-7,8 en bovino. Está inversamente relacionado con la concentración espermática. El metabolismo espermático acidifica el medio y presencia de sustancias contaminantes como la orina y procesos inflamatorios le dan valores más altos[2].

Concentración espermática:

Permite evaluar la capacidad de producción de espermatozoides del semental y calcular el número de dosis a producir por eyaculado. Existe correlación entre la concentración y fertilidad[5]. Se observan variaciones en función del individuo, estación del año, frecuencia y técnica de recogida, etc., si bien la concentración media está entre 60-350 x10⁶ (equino) y 800-1000 x10⁶ (bovino) espermatozoides/ml[2]. Entre los diferentes métodos de evaluación:

• Cámaras de recuento celular: Neubauer /Thoma. Contaje manual.
• Espectrofotómetro: relaciona el grado de absorción de la luz que provocan los espermatozoides diluidos      a una concentración conocida, con la concentración de la muestra. Rápido y con menor coeficiente de variación que el anterior (2.9%  vs. 12.3%)^[6]  pero los valores pueden verse afectados por contaminaciones.
• Contadores celulares electrónicos: cuentan partículas con un tamaño prefijado.
• Sistemas CASA (Computer Assisted Sperm Analysis).

Motilidad espermática:

Proporciona los datos más importantes sobre calidad y vialidad de una muestra espermática. Se evalúa (referente a bovino y equino):

•   Movimiento total: porcentaje de espermatozoides mótiles. (60% a 90%)^[2]. En bovino, debido a la elevada concentración espermática, se habla de motilidad masal (escala de 1 a 5, evaluando como 1 al semen que no presenta ondas y 5 cuando las ondas se mueven rápidamente formando remolinos).
•  Movimiento progresivo (motilidad individual): porcentaje de espermatozoides con trayectoria progresiva en línea recta. El rango posible comprende desde un 40% a un 90%, siendo el valor mínimo aceptable del 50%^[2].
•   Vigor de movimiento. Se evalúa al mismo tiempo que la motilidad individual, teniendo en cuenta la velocidad con la que estos espermatozoides atraviesan el campo. La escala que se utiliza es de 0 a 5 (rangos posibles), evaluando como 0 los espermatozoides inmóviles y como 5 los que avanzan rápidamente por el campo y son difíciles de seguir visualmente.^[7].

La valoración debe realizarse con el semen diluido. El diluyente se agrega al eyaculado (libre de gel en el caso del equino), previamente atemperado a 37º C. Los componentes del diluyente proveen al semen sustratos energéticos para su supervivencia y motilidad, tienen la capacidad de amortiguar el pH, controlando la acidez, y de mantener una presión osmótica adecuada, contienen macromoléculas que lo protegen contra el shock frío (yema de huevo, leche) y antibióticos que reducen la proliferación bacteriana. Si el semen va a ser congelado, el diluyente contendrá agentes crioprotectores. Diluciones bajas tipo 1:1 (semen:diluyente) no son adecuadas para preservar el semen. El nivel de dilución debe hacerse en función de la concentración inicial de la muestra espermática (25 a 50 x10⁶ espermatozoides/ml en equino). Concentraciones muy altas hacen que los espermatozoides compitan por los nutrientes y aumenta el nivel de metabolitos en el medio, por lo tanto disminuye su longevidad.

  Además, dicha valoración debe llevarse a cabo en un medio adecuado y controlando la temperatura de las superficies que entran en contacto con la muestra (37 ºC). Es una valoración subjetiva bajo microscopía óptica de una muestra de 10 µl[6].

Longevidad de la motilidad espermática:

Valoración de la motilidad a diferentes tiempos (12, 24, 48 y 72 horas) y temperaturas (corporal y de refrigeración a 4 ºC)[6]. Esta prueba permite determinar la viabilidad del semen en el tracto de la hembra, así como su calidad y viabilidad tras la refrigeración. La longevidad espermática a la refrigeración guarda gran correlación con la capacidad de congelación del semen.

      El factor dilución es determinante en la longevidad del semen (debido a los componentes incluidos en el diluyente), de forma que a mayor dilución mayor longevidad (manteniendo un mínimo de espermatozoides por dosis). El esperma puro mantendrá espermatozoides móviles hasta 18-24 horas, mientras que el fresco diluido lo hará hasta las 48 horas[7].
              
     Mediante la dilución de la muestra seminal conseguimos aumentar la longevidad porque disminuimos el efecto negativo del plasma seminal. La presencia del plasma seminal disminuye el tiempo de supervivencia del semen refrigerado porque en el momento siguiente a la recogida los espermatozoides presentan un metabolismo muy elevado y el plasma seminal tiene una baja capacidad de protección. Debido a la variabilidad individual en la composición del plasma seminal entre caballos puede ser necesaria la centrifugación en sementales considerados como “malos refrigeradores” y en aquellos con bajas concentraciones de espermatozoides (< 100x10⁶ espermatozoides/ml). 

     
        Estudios en porcino revelan que la bacteriospermia es un hallazgo frecuente en el semen diluido (resistencias, componentes nutritivos de los diluyentes, temperaturas) y puede resultar en detrimento de la longevidad y calidad del semen, si esta no es controlada (Althouse y Lu, 2005). Los procesos de recolección, dilución e inseminación deben ser realizados conservando las mejores condiciones higiénicas para, de esta manera, no interferir en la fertilidad (Martínez, 1998; Thacker et al., 1984; Toniolli et al., 2002)[8].

Morfología espermática:

Se basa en la relación directa existente entre la proporción de espermatozoides anormales en el eyaculado, el tipo de defecto y su relación con la fertilidad in vivo[5]. La evaluación de las anomalías morfológicas puede realizarse sobre preparaciones húmedas o fijadas en un portaobjetos. El rango de presencia de anomalías en un semen de calidad está entre 10% y 25%[2]. Altos porcentajes se asocian a inmadurez sexual, procesos degenerativos y patológicos y un alto régimen de recogidas.

Mayoritariamente, las anomalías se clasifican en:

• Primarias: de origen testicular, producidas durante la espermatogénesis. Corresponden a anomalías de la cabeza, pieza intermedia o inserción de la cola.

o       Específicas: de origen genético. Pueden afectar a cualquier estructura espermática.

o       No específicas.

Morfologia espermática del semen de caballo: a)normal; b)acrosoma desprendido,
c)inserción abaxial, d)gota citoplasmática,
e)anomalías de la pieza intermedia, g)anomalías de la cola.

• Secundarias:  desarrolladas en el epidídimo a lo largo del proceso de maduración espermática, suelen corresponder a presencia de gotas citoplasmáticas. Afectan fundamentalmente a la cola del espermatozoide.

• Terciarias: originadas por manipulación incorrecta del semen tras la recolección.                    

ANÁLISIS SEMINALES ALTERNATIVOS:

Algunos machos pueden mostrar bajos índices de fertilidad a pesar de presentar un seminograma normal. En estos casos se recomienda recurrir a pruebas alternativas para estudiar otros parámetros.

Vitalidad espermática:

    Se valora indirectamente mediante la integridad de la membrana plasmática.  El estudio se hace mediante tinciones:

- Tinciones no fluorescentes:

o    Eosina – nigrosina: permite diferenciar entre espermatozoides vivos (no teñidos) y muertos (color rojizo por la penetración de eosina al existir pérdida de la continuidad de la membrana).

o       Tripán azul: vivos (no teñidos) y muertos (teñidos de azul).

- Tinciones fluorescentes: uno de los fluorocromos más utilizados para identificar células muertas es el Ioduro de Propidio (PI). Este compuesto entra en espermatozoides con la membrana plasmática dañada, se une al núcleo y, al ser excitado por una longitud de onda de entre 510-560 nm, emite fluorescencia roja. Además existen otros marcadores fluorescentes específicos para células muertas cuyo mecanismo de acción es similar, como el Hoechst 33258, el bromuro de etidio o la hidroetidina (HED). El SYBR-14 suele utilizarse en combinación con PI, y distingue dos poblaciones espermáticas, una de ellas constituida por células muertas o en estado de degeneración, cuyas membranas plasmáticas son permeables al PI (emiten fluorescencia roja); y la otra constituida por espermatozoides viables, cuyas membranas intactas son impermeables al PI pero dejan entrar el SYBR-14, y por tanto emiten fluorescencia verde. Un fluorocromo con un mecanismo de acción similar al del SYBR-14, capaz de identificar espermatozoides vivos, es el Hoechst 33342. Este compuesto también entra en células vivas y se une al ADN espermático, sin embargo, su uso está limitado por la longitud de onda de su espectro de excitación, que está en el rango UV. La mayoría de los citómetros disponen de un láser con una longitud de onda de 488 nm, y para evaluar las muestras marcadas con Hoechst 33342, es preciso disponer de un láser de menor longitud de onda[3].

Mediante la tinción con naranja de acridina (método SCSA –Sperm Chromatin Structure Assay-), podemos estudiar el grado de desnaturalización de la cromatina de los espermatozoides: emisión de fluorescencia roja cuando se une al ADN desnaturalizado y verde cuando se une al ADN normal de un espermatozoide intacto. Cuanto mayor sea el cociente fluorescencia roja/fluorescencia total, la probabilidad de conseguir una gestación a término es menor.

Integridad del acrosoma:

El acrosoma es fundamental en el proceso de fecundación. Especialmente importante tras la descongelación ya que el espermatozoide sufre daños a nivel acrosomal durante dicho proceso[6].

Una técnica a seguir pude ser la triple tinción, que permite valorar la vitalidad y el estatus acrosomal al mediante el empleo de tripán azul (colorante vital), marrón de Bismark (colorante postacrosómico) y rosa de Bengala (colorante acrosómico).

  Además de la triple tinción, se emplea la tinción eosina/verde rápido, Giemsa, eosina/nigrosina y otras tinciones dobles. La valoración de los espermatozoides, incluso de especies cuyo tamaño es relativamente pequeño (équidos, porcino, entre otras), se puede realizar mediante un microscópio óptico de contraste de fases con objetivo de 60x[5].

          La citometría de flujo también permite valorar la integridad acrosomal, además de la funcionalidad mitocondrial y el estado de capacitación de los espermatozoides, así como la obtención de muestras de espermatozoides sexados (bovino)[4]. Tiene el inconveniente de que se necesita disponer de un citómetro (coste).

Cuando se utiliza la citometría de flujo como método de análisis, la integridad acrosomal se valora mediante una lecitina conjugada con un fluorocromo. Las lecitinas más frecuentes son la PNA (peanut agglutinin), que se une a la membrana acrosomal externa (en su cara interna), y la PSA (pisum sativum agglutinin), que se une a la matriz acrosomal y la membrana acrosomal externa. Los espermatozoides con al membrana dañada, posibilitan el paso de la lecitina conjugada al compartimento acrosomal[3].
Otra posibilidad para identificar la presencia de alteraciones acrosomales es el uso de anticuerpos monoclonales, marcados con un fluorocromo, frente a moléculas específicas del contenido acrosomal[4].

Para valorar simultáneamente el estado del acrosoma y la viabilidad, se pueden combinar tres fluorocromos (SYBR-14 y PI, para viabilidad; PNA, para integridad acrosomal)[3].

Análisis morfométrico computerizado:

Permite una valoración morfológica objetiva usándose equipos de análisis de imagen computerizados (sistemas CASA). Existe relación entre alteraciones morfométricas importantes de los espermatozoides y problemas de fertilidad. Además permite valorar los cambios morfológicos producidos tras la descongelación[4].

Análisis computerizados de motilidad espermática:

Mediante el uso del sistema CASA es posible valorar de forma objetiva la motilidad seminal. Permite la obtención de parámetros como el porcentaje de espermatozoides móviles, velocidad curvilínea (VCL), rectilínea (VSL), media (VAP), índice de linearidad, rectitud, oscilación, amplitud del desplazamiento lateral de la cabeza, frecuencia del batido del flagelo, etc. También identifica la existencia de subpoblaciones espermáticas con distintos patrones de movimiento que coexisten en la misma muestra, lo cual es una visión más real que la motilidad media, puesto que, un eyaculado está constituido por una población heterogénea de espermatozoides. La presencia de estas subpoblaciones podría sugerir la existencia de alguna relación entre cambios en la estructura subpoblacional de una muestra y su capacidad fecundante[4].

Test de resistencia osmótica:

 Valora la integridad de la membrana plasmática a través de su capacidad para intercambiar líquidos. El más utilizado es el HOST (hipoosmotic swelling test). Cuando un espermatozoide intacto se somete a una solución hipoosmótica responde incorporando agua a su medio intracelular y se evidencia por un enrollamiento de su cola[5].

  

a)endósmosis negativa, b-g)distintas manifestaciones de endósmosis positiva.

Otras pruebas:

·     Test bioquímicos: la producción de L-Lactato valora el metabolismo energético de los espermatozoides.

·    Valoración de enzimas: GOT, LDH, hialuronidasa. Su valoración en el plasma seminal indica el grado de daño del acrosoma y membrana plasmática.

·      Microscopía electrónica.

·      Test de penetración heteróloga.

·      Valoración de receptores de progesterona en la membrana plasmática.

·      Análisis de plasma seminal.

DISCUSIÓN:

Ø  Las cualidades que deben tener los espermatozoides de un eyaculado son motilidad progresiva, morfología normal, integridad estructural y funcional de la membrana, metabolismo activo, enzimas asociadas con la fecundación, capacidad de penetración y transferencia óptima del material genético, sin embargo existe dificultad en el análisis integral, por la complejidad de la función espermática[5].

Ø     La existencia de un número tan elevado de test pone de manifiesto que ninguno de ellos es válido por sí mismo[6]. Por ello el uso combinado del análisis seminal básico con alguna prueba alternativa aumenta la efectividad y la veracidad en la estimación de la calidad de un semen fresco así como crioconservado.

Ø  Para cumplir su función satisfactoriamente, el semental debe reunir ciertas características de buena cantidad y calidad de semen, libido y capacidad de monta. Un pedigree valioso y/o una conformación ideal valen poco si el macho no es eficiente preñando hembras.

Ø    Debemos de tener en cuenta que los toros de razas de carne alcanzan la pubertad más tarde que los de razas de leche (18 meses en vez de 14); además los eyaculados de toros jóvenes tendrán un volumen más bajo y por lo general una menor concentración que los toros maduros. Los equinos también presentan variaciones dependiendo de la raza, y en comparación con el bovino, presentan un volumen mayor de eyaculado y una menor concentración espermática. Éstos, además presentan la peculiaridad de excretar un gel (tapioca) que se filtrará para su eliminación en el momento de la recogida.
ØEl conocimiento de la fertilidad o de la capacidad fecundante de cada semental, se convierte en unos de los principales objetivos en la producción de semen bovino o equino. En el caso del bovino, un requisito indispensable para el desarrollo de esta biotecnología, es que el semen utilizado mantenga su capacidad de fertilidad después de haber sido criopreservado^[5].

BIBLIOGRAFÍA:

[1] Bearden, H. J., Fuquay, J. W. Evaluación del semen. En: Reproducción animal aplicada. México, D.F.: El Manual Moderno, S. A. de C. V., 1982: 153-185.

[2] Gómez-Cuétara, C. El examen de compra en los sementales. Equine Medicine. Improve Ibérica. Módulo 13 (01/10/2011).

[3] Muiño, R. Evaluación de la motilidad y vialidad del semen bovino mediante el uso de sistemas CASA y citometría de flujo: identificación de subpoblaciones espermáticas. Tesis doctoral. Universidad de Santiago de Compostela. Facultad de Veterinaria. Disponible en: http://dspace.usc.es/bitstream/10347/2406/1/9788497509886_content.pdf. Descarga: enero 2013.

[4] Muiño, R., Fernández, M., Areán, H., Viana, J.L., López, M., Fernández, A., Peña, A.I. Nuevas tecnologías aplicadas al proceso y evaluación del semen bovino en centros de inseminación artificial. Itea (2005). Vol 101 (3). 175-191. Disponible en: http://www2.cita-aragon.es/citarea/bitstream/10532/1154/1/10532-1064_1.pdf. Descarga: enero 2013.

[5] Olegario, C., Tamargo, C., Díez, C. Análisis del semen bovino. Boletín informativo del SERIDA (Asturias), nº 2. 2012.

[6] Miró, J., Ocaña, M. El análisis seminal. Importancia, posibilidades y su relación con la fertilidad. Equinus. 2006. Nº 16. 53-68.

[7] http://www.uco.es/organiza/departamentos/medicina-cirugia/reproduccion/proyecto2. Acceso: enero 2013.

[8] Pineda, Y., Santander, J. Evaluación de la flora bacteriana del semen de verracos en granjas porcinas de Venezuela. Zootecnia Tropical, Vol. 25, No. 3, 2007, pp.173-177. Disponible en: http://www.bioline.org.br/request?zt07023. Descarga: enero 2013.

Autores:

González González, Jimena.

Martínez Martínez, Yaiza.

Sánchez Paniagua, Diana I.

                                    

Máster en Biología y Tecnología de la Reproducción

Universidad de Oviedo 2012-2013