Lavado seminal como alternativa de reproducción para parejas VIH serodiscordantes

Introducción

El virus de la inmunodeficiencia humana (VIH), cuya manifestación más grave es el SIDA (síndrome de la inmunodeficiencia humana), es un retrovirus que se transmite por vía sanguínea, sexual o vertical. Afecta sobre todo a los linfocitos T, a los macrófagos y a las células del sistema nervioso central que tienen en común el receptor vírico, la molécula CD4. [2]

La introducción de los tratamientos antirretrovirales de gran actividad (TARGA) ha retrasado e incluso evitado la progresión del sida consiguiendo alargar la supervivencia y la calidad de vida de las personas afectadas por el VIH-1. Estos avances han hecho modificar el concepto de una enfermedad asociada a un rápido desenlace, por el de una enfermedad de desarrollo crónico con una expectativa de vida parecida a la de otras patologías crónicas. Con esto, muchos individuos seropositivos se plantean la posibilidad de tener descendencia. [1,2]

En relación a la carga viral y su comparación entre plasma sanguíneo y plasma seminal, estudios sugieren que éstos se comportarían como compartimentos diferentes. Los tratamientos con antirretrovirales reducen los niveles en sangre y plasma, pero aun así, el VIH puede seguir estando presente y con capacidad infectiva en plasma seminal y células no espermáticas aunque haya niveles indetectables en sangre. Esto es debido a que la difusión de los antirretrovirales a los compartimentos genitales es bastante variable, ya que puede que no consigan penetrar porque las células germinales se encuentran protegidas mediante la barrera hemato-testicular que evita la entrada de ciertas sustancias, incluyendo numerosos fármacos. [1]

Por otro lado, existe mucha controversia acerca de la presencia o no de partículas víricas en los espermatozoides móviles, sobre todo fundamentada en datos ya obsoletos que sembraron la duda acerca del uso de estos espermatozoides con fines reproductivos. Aunque no se ha podido demostrar que el espermatozoide pueda transmitir el retrovirus, los casos clínicos llevados a cabo mediante lavado seminal, nested-PCR e ICSI (inyección intracitoplasmática de espermatozoides), muestran la efectividad del procedimiento sin que se haya producido ninguna seroconversión en madres ni en recién nacidos. [1,2]

Técnica de lavado^[1]

El lavado de semen de hombres con infección por el VIH-1 es una técnica que se realiza para separar los espermatozoides móviles del resto del semen y así, eliminar o reducir el riesgo de transmisión de la infección a la madre y al bebé. A continuación, estos espermatozoides se utilizan para la inseminación de la mujer mediante inseminación artificial (IA) cuando se encuentra en proceso de ovulación, o fecundación in vitro (FIV).

La técnica de eliminación del VIH-1 consiste en aplicar a la muestra de semen un doble proceso de lavado: el gradiente de densidad y el swim-up [Figura 1]. Estas dos técnicas se utilizan habitualmente en reproducción humana para separar y seleccionar los espermatozoides móviles aptos para fecundación. La diferencia con el lavado de semen de pacientes VIH-1 positivos es que se utilizan las dos técnicas de forma conjunta.

El procedimiento utilizado para el lavado seminal es el siguiente:

1. Obtención de la muestra de semen por masturbación después de 3-7 días sin eyaculación. El semen ha de tratarse durante la primera hora posteyaculación.

2. Licuefacción del semen a temperatura ambiente de 10-40 minutos.

3. Valoración morfológica del semen según los criterios de la OMS 2010.

4. Separación de los espermatozoides móviles del resto de semen mediante:

  • Aplicación del gradiente de densidad.

  • Realización de uno o dos lavados con un medio de lavar espermatozoides.

  • Aplicación del swim-up al pellet obtenido.

5. La muestra obtenida de espermatozoides se divide en varias partes:

 • Valoración de la muestra mediante recuento de espermatozoides y porcentajede movilidad en el caso de que no se haya realizado anteriormente.

  • Determinación del VIH-1 mediante PCR.

  • El resto, para realizar la reproducción asistida en el caso de que la PCR sea negativa.

La técnica de la PCR se aplica a los espermatozoides móviles obtenidos del semen lavado para identificar la presencia de ARN o ADN viral. En caso negativo, estos espermatozoides pueden ser utilizados en IA o FIV.

Centrifugación con gradientes de densidad

Consiste en formar diversas capas de diferentes densidades. Para realizar los gradientes de densidad se utiliza una solución isotónica (PureSperm®, SpermFilter®, Ficoll®) y se hacen tres capas de concentraciones al 50%, 70%, y 90% para separar las diferentes fracciones celulares del semen. Se coloca 1 ml de cada concentración, de mayor a menor densidad en un tubo cónico de centrifugación de gradientes. A continuación, se pone la muestra de semen y se centrifuga el tubo a 300 - 400 ×g durante 20 o 30 minutos (dependiendo del laboratorio). Cuando se realiza la centrifugación cada componente del semen empieza a bajar por el gradiente, hasta que llega a la zona en que la densidad de la solución es igual a su densidad.

La velocidad a la que sedimenta cada uno de los componentes depende fundamentalmente del tamaño y de su forma. Los componentes más pequeños necesitan más fuerza de centrifugación y más tiempo para llegar a la capa de la misma densidad. Después de la centrifugación los espermatozoides móviles se localizan en el fondo del tubo. Para recuperarlos, se pueden ir sacando las capas superiores hasta llegar a la del 90% con la ayuda de diferentes pipetas o bien perforar el fondo del tubo para retirar el pellet por debajo.

Técnica de swim-up

Se basa en una selección de los espermatozoides móviles. El pellet recuperado con la centrifugación por gradiente de densidad se coloca en un tubo estéril con un medio de cultivo (human tubal fluid y human serum albumin con unaproporción de 1:2), después se pone inclinado a 45ᵒ en la incubadora, con una temperatura de 37ᵒC y una atmósfera de CO₂ del 5% durante una hora. Pasado este tiempo se recoge el sobrenadante donde se encontrarán los espermatozoides móviles que habrán nadado desde el pellet. La muestra obtenida se fracciona en dos partes iguales, una se utiliza para el estudio del VIH-1 por PCR y la otra se congela y se utiliza para la IA/FIV, una vez confirmado por PCR la no evidencia del VIH-1.

Detección del VIH-1 en las muestras tras el lavado del semen

El método de detección más empleado es la PCR estándar. Consiste en la amplificación enzimática de secuencias específicas del material genético, y permite la cuantificación del ADN y del ARN del HIV de los espermatozoides móviles obtenidos del semen lavado (carga pro-viral y viral).

Los procedimientos de PCR estándar, como los empleados para la cuantificación de los niveles virales en sangre, cuando se utilizan para determinar los niveles virales en muestras de plasma seminal puede que no sean suficientes ya que existe un límite en el número de copias que puede detectar. La sensibilidad de la técnica es de 200 copias/ml de ARN y al menos 10 células infectadas. Es posible que unos pocos espermatozoides contengan VIH y no sean detectados, pero es imposible estar seguro al 100% ya que la PCR se aplica a una fracción de la muestra de espermatozoides y será la otra fracción la que se usará para la IA o FIV.

El empleo de esta técnica puede dar lugar a la aparición de falsos negativos debido a la presencia de inhibidores de la polimerasa, presentes en el semen, que bloqueen la reacción o a que el número de células o viriones esté por debajo de los niveles de sensibilidad de la técnica.

En la actualidad, la técnica que ha demostrado tener mayor sensibilidad para determinar la presencia/ausencia de ácidos nucleicos de VIH en espermatozoides lavados es la nested–PCR (modificación de la PCR destinada a reducir la unión no específica de productos debido a la amplificación de sitios de unión de primers inesperados). Este método permite la detección de una única copia viral de ARN o ADN. Con la aplicación de este método de detección, se ha demostrado que muchas muestras que se consideraban negativas mediante el uso de métodos comerciales de detección, no estaban completamente libres de partículas virales.

La calidad del semen puede estar afectada por la propia infección del VIH, por los tratamientos antirretrovirales utilizados, y en caso de utilizar técnicas de reproducción humana asistida (RHA) para prevenir la transmisión horizontal, por el mismo proceso de lavado de semen. Aunque algunos autores han constatado cambios en el patrón de movilidad, volumen de eyaculado y en el número total de espermatozoides,  no se han hallado diferencias significativas entre los grupos, pudiéndose comparar todos los parámetros y por tanto, estas variaciones no son suficientemente marcadas para alterar gravemente la fertilidad (Tabla I).

Tabla I: Comparación de características seminales entre un grupo infectado por VIH y un grupo control. A, B, C, D= tipo A, B, C y D de movilidad.

Parámetros seminales	Control	VIH
	73	73
Volumen (ml)	3,4 ± 0,23	3,7 ± 0,2
Concentración (spz./ml)	82,3 ± 11,2	78,4 ± 12,3
A	0,2 ± 0,1	0,3 ±0,1
B	48,1 ±3,2	45,1 ± 4,1
A + B	48,3 ± 3,8	45,3 ± 4,0
C	14,5 ± 302	14,3 ± 2,2
TMP (×106/eyaculado)	140,6 ± 12,0	136,1±13,3

No existen suficientes datos que expliquen el pequeño porcentaje de casos en los que este procedimiento da resultados positivos, obligando a repetir la técnica para conseguir obtener muestras de espermatozoides limpios de virus. La aparición de resultados positivos puede ser debido a una incorrecta manipulación de la muestra durante el procedimiento de lavado dejando presente en la muestra células no espermáticas susceptibles de infección como son linfocitos y/o macrófagos.

Técnicas de Reproducción Asistida^[1,3,4]

La inseminación artificial ha sido el método a elegir en los tratamientos de reproducción asistida en parejas serodiscordantes desde hace varias décadas, si las pruebas ginecológicas de la mujer lo han permitido, y el recuento de espermatozoides móviles es suficiente.

Sin embargo, existen diversos casos en los que no está indicado el uso de la inseminación artificial, como por ejemplo, mujeres seronegativas con obstrucción de trompas de Falopio, casos de baja calidad seminal o con un bajo número de espermatozoides totales tras el lavado seminal, o en fallos repetidos en las inseminaciones artificiales realizadas. En estos casos estaría recomendado el uso de ICSI o FIV.

Las ventajas que tiene el uso de ICSI en lugar de IA en pacientes serodiscordantes para el VIH son:

·        Disminuye el riesgo de infección con el uso de un único espermatozoide por ovocito, frente a los millones que recibe la mujer en un ciclo de inseminación artificial.

·   No se cancelan ciclos si los lavados resultan positivos. Los espermatozoides pueden mantenerse congelados tras el lavado, haciendo posible la repetición de las pruebas de detección las veces que sea necesario hasta la obtención de resultados adecuados, debido a que la muestra se procesa antes de iniciar el ciclo.

·        Las tasas de embarazo son mucho más elevadas en ICSI, incluso tres veces más que con IA, reduciendo así el tiempo necesario para la concepción, con la consiguiente disminución de la ansiedad y estrés de la pareja sometida a este tipo de tratamientos y con ello la exposición viral con ciclos repetidos, sin tener en cuenta la capacidad de fecundación de la pareja a tratar.

·       Rentabilización de todo el lavado. Los espermatozoides lavados que resulten negativos, pueden ser utilizados en tantos ciclos como sean necesarios, sin la necesidad de realizar nuevos lavados que incrementen el coste de todo el proceso.

·        No se necesita recuperar un número importante de espermatozoides para conseguir índices adecuados de embarazo post-lavado.

La desventaja de la ICSI frente a la IA son los efectos secundarios asociados a este tipo de procedimientos en las mujeres como puede ser el riesgo de hiperestimulación ovárica o las contraindicaciones de la medicación.

Conclusiones^[1]

En la actualidad, podemos afirmar que el semen es un vehículo de transmisión de la infección por el VIH, aunque su presencia dentro del espermatozoide o en las células germinales es un tema muy controvertido que todavía está por resolver. El lavado seminal, nested-PCR e ICSI, son los procedimientos más adecuados para reducir el riesgo de transmisión del VIH en parejas serodiscordantes con el hombre infectado que quieren tener hijos, independientemente de su fertilidad.

Aunque no se puede demostrar que el VIH no se adhiera fuertemente al espermatozoide o lo infecte, la experiencia mostrada indica que con la metodología descrita, el riesgo de transmitir el VIH a través de espermatozoides lavados es inferior o nulo, al observado en parejas serodiscordantes que efectúan coito no protegido. Además, los resultados muestran que la técnica del lavado de semen en hombres seropositivos al VIH para su uso en técnicas de reproducción asistida no ha producido ninguna seroconversión horizontal ni vertical al virus.

Bibliografía:

1.       Lavado seminal en varones seropositivos para el VIH ¿está todo resuelto? Mª Carmen Galbis, José Remohí, Antonio Pellicer, Nicolás Garrido. Revista Asebir. Junio 2012.

2.       Informe Técnico: Lavado de semen en parejas VIH serodiscordantes para su uso en técnicas de reproducción humana asistida. Agencia de Evaluación de Tecnologías e Investigaciones Médicas. Septiembre 2004.

3.       Assisted reproductive technologies to establish pregnacies in couples with an HIV-I-infected man. E. van Leeuwen, S. Repping, J.M. Prins, P. Reiss, F. van der Veen. Septiembre 2009.

4.       HIV y reproducción asistida. Reproducción Asistida en parejas serodiscordantes (hombre seropositivo) al VIH-1: experiencia de 118 niños nacidos sanos. Simón Marina, Fernando Marina, Rosabel Expósito, Ruth Alcolea, Natalia Pérez, Blanca Bermejo, Marta Sánchez, Joan Huguet. Ginecología y Obstetricia Clínica 2002

Tania Fernández Navarro
Patricia Magadán Corpas

Máster en Biología y Tecnología de la Reproducción 2013-2014