MÉTODO DE SELECCIÓN MOLECULAR DE ESPERMATOZOIDES: separación magnética por columnas de anexina V

En los últimos años, el factor masculino ha incrementado su importancia debido a una mayor concienciación por parte del varón y a un aumento de los estudios de esterilidad en el hombre. El análisis del semen incluye la valoración de la concentración, la motilidad y el porcentaje de formas normales de espermatozoides, entre otros estudios básicos, siguiendo el procedimiento estandarizado para evaluar el potencial de la fertilidad masculina (World Health Organization, 2010). Este  análisis no aporta información  sobre procesos subcelulares que tienen lugar en el esperma y en muchos casos no se alcanza el diagnóstico fisiopatológico de la infertilidad masculina.

El análisis de la fragmentación del ADN aportó nuevas expectativas en la búsqueda de la explicación a los fallos repetitivos de FIV-ICSI. Se ha descrito la importancia de la estabilización del núcleo  espermático en el éxito reproductivo en humanos. Así, el incremento significativo de los niveles de fragmentación  del ADN estaría asociado a bajas tasas de fertilización, implantación embrionaria e incremento de abortos.

El término apoptosis define la muerta celular programada, la cual es molecularmente  y morfológicamente diferente de la necrosis.  Los modelos de apoptosis incluyen aquellas vías mediadas por receptores y aquellas con activación intrínseca, además de las inducidas por estrés oxidativo. La fosfatidilserina es un marcador temprano de la apoptosis que se externaliza en la membrana en las fases inciales de la misma. La fragmentación del  ADN, expresión de Caspasa 3  y los cambios morfológicos que ocurren en la célula se consideran marcadores más tardíos del proceso.

Los altos niveles de fragmentación del ADN son el criterio de valoración principal y una señal patognomónica  del proceso de apoptosis .  Tanto factores físicos como metabólicos pueden inducir el daño del ADN espermático. Éste puede ocurrir en la espermatogénesis o durante el tránsito por el epidídimo. Asimismo, se han identificado factores de riesgo asociados al incremento de la fragmentación del ADN como varicocele, criptoquidia, edad avanzada, teratozoopermia severa, episodios de fiebre alta, radio y quimioterapia.  

El daño en el material genético puede ser  de simple y/o  doble cadena y ha podido ser evaluado por diversos métodos, destacando entre ellos la técnica de TUNEL ( deoxynucleotidyl-transferase-mediated-dUTP-nick-end-labelling). 

A lo largo de las pasadas décadas una gran variedad de procedimientos estandarizados han sido desarrollados con algunas modificaciones. Estas técnicas convencionales de separación espermática pueden ser clasificadas en base a que utilicen centrifugación, filtración o migración espermática.

En búsqueda de un método no invasivo que permita dar solución  a los altos niveles de fragmentación del ADN y apoptosis celular en espermatozoides se ha descrito el uso de columnas de anexina V acopladas a pequeñas esferas metálicas (microbeads) recubiertas de un polímero biodegradable (50nm de diámetro). Las mismas pueden ser usadas para separar espermatozoides muertos y apoptóticos cuando se les somete a un campo magnético de alto poder en una columna de afinidad. Este procedimiento de separación o filtrado molecular se denomina “Magnetic- Activated Cell Sortin, MACS”, o Separación Magnética por Columnas de Anexina. El principio consiste en que los espermatozoides con externalización de fosfatidilserina  y membranas plasmáticas deterioradas se unirán a anexina V que, acopladas a las microesferas, quedarán adheridas  a la columna de separación (fracción positiva). Por otro lado, los espermatozoides no apoptóticos con membranas intactas no se unirán a Anexina V y pasarán libremente a través de la columna (fracción negativa). De esta manera se logra la selección de espermatozoides no apoptóticos y se enriquece la muestra con espermatozoides que aumentan el potencial de fertilización en una técnica de reproducción asistida.

La  responsabilidad del éxito reproductivo está compartida entre el gameto masculino y femenino.

Prestando especial atención al varón, su contribución se estima en un 20% como factor único y un 50 % en conjunción con el factor de infertilidad femenina. Por este motivo es imprescindible disponer de criterios objetivos para  realizar la selección de espermatozoides con una mayor posibilidad de conseguir embriones competentes que resultan en un recién nacido vivo sano.

Es importante destacar, que a diferencia con otras técnicas, ésta es eficaz en la reducción del número de espermatozoides preapoptóticos y fragmentados, disminuyendo solamente en un 20% la movilidad de estos y aumentando su supervivencia.
La inclusión de esta técnica en centros de reproducción asistida evidencia una mejoría de los resultados obtenidos en ciclos de fertilidad a través de ICSI.

Bibliografía:

- Vanesa Rawe, Gustavo Álvarez, Heydy Uriondo, Sergio Papier, Sandra Miashik, Floroncis Nadir. Separación magnética por columnas de anexina V: filtrado molecular para la selección de espermatozoides no apoptóticos. Reproducción 2009; 24: 104-114

- MS. Cristian Alvarez Sedo, MS. Mariano Lavolpe, MS Heydy Uriondo,  et col. Nuclear vacuoles and apoptosis markers afeter annexin V  columnns in patients with severe teratozoospermia.

- Paaschu, Grunewald S, Fitald G et col ( 2003) . Deterioration of plasma membrana is associated  with activated caspasas in human espermatozoo. Journal Andrology 24: 246-252.

 

Laura Díaz López, Lorena Revilla Gutíerrez, María Tresguerres Fernández