SEMEN SEXADO EN LA ESPECIE EQUINA: LIMITACIONES AL USO COMERCIAL

Introducción

         La capacidad de poder seleccionar el sexo de la descendencia antes de la concepción, ha sido siempre un gran reto para científicos y ganaderos, ya que esta posibilidad mejoraría la relación coste-beneficio de un programa de cría de cualquier especie, aunque los motivos de dicha selección son muy variables en función de la especie en cuestión. La producción de animales machos o hembras tiene beneficios económicos obvios tanto en la industria lechera como en la cárnica, sin embargo, en especies domésticas como es el caso del caballo, la preferencia entre un sexo u otro es algo mucho más subjetivo (Samper et al. 2012).

Es evidente que la selección del sexo de la descendencia ofrece ventajas en la industria equina, ya que ciertas disciplinas tienen preferencias por un sexo específico, como es el caso de la doma clásica, en la que se prefieren machos, al contrario que en el polo, donde se prefieren hembras (C. M. Balao da Silva et al. 2013), ya que parece ser que éstas son más audaces y valientes. La selección de un determinado sexo también está condicionada por las aptitudes físicas de cada género, un ejemplo de ello lo tenemos en las disciplinas de “raid” y “cross country” donde existe una preferencia de machos, debido a que tienen menos tendencia a sufrir rabdomiolisis. Puesto que los caballos se emplean principalmente en disciplinas deportivas, su utilidad se ve a menudo comprometida a causa de las lesiones. Los caballos castrados, que son los que se utilizan en muchas competiciones, evidentemente no pueden utilizarse con fines reproductivos, por lo que cuando sufren lesiones severas, en la mayoría de los casos son sacrificados. Frente a esta situación, si se utilizan hembras de alto valor genético, su utilidad se puede mantener si sufren lesiones y son retiradas de la competición, introduciéndolas en programas de cría (Gibb et al. 2011).

Sin embargo, los costes de trabajar con semen sexado no sólo se ven aumentados por el mayor precio de la obtención de la dosis de semen, ya que existe un alto precio a pagar por la reducción en la fertilidad, que es considerable, y el aumento de la mano de obra que todo ello conlleva.

Métodos de preselección de sexo

            Se ha comprobado que las células espermáticas pueden separarse basándose en las diferencias físicas entre los cromosomas X e Y.  En la clínica andrológica humana se intentó separar los dos tipos de espermatozoides, basándose en la mayor velocidad de los espermatozoides Y con respecto a los espermatozoides X, mediante la utilización de columnas de albúmina, sin embargo no se obtuvieron muy buenos resultados (Morris 2011).

Actualmente, el único método repetible y fiable de selección de espermatozoides en base al sexo cromosómico, está basado en la tecnología de separación de Beltsville que utiliza la citometría de flujo, y que fue adaptada por primera vez para espermatozoides por Gledhill y colaboradores en 1976 (Gledhill et al. 1976). A partir de entonces se hicieron algunas modificaciones que permitieron orientar los espermatozoides hacia el haz de luz del láser, lo que mejoró sustancialmente la tasa de separación y la precisión del procedimiento (L. A. Johnson and Pinkel 1986). La tinción vital del ADN espermático permitió la producción de la primera descendencia viva preseleccionada en conejos, y desde entonces la separación de espermatozoides por citometría de flujo, ha producido nacimientos sanos en numerosas especies animales, como en la equina o en la humana, y aunque estos éxitos demuestran la capacidad fecundante de los espermatozoides separados mediante el procedimiento conocido como FACS (Fluorescence-Activated Cell Separation), es decir, discriminación celular activada por fluorescencia, el procedimiento continúa presentando problemas y retos en todas las especies, aunque en unas más que en otras (Morris 2005).

Principios de la separación de espermatozoides por sorting

            El sexo de la descendencia se determina en el momento de la fecundación, cuando el espermatozoide que porta el cromosoma X o el Y fecunda el ovocito. La separación de ambos tipos de espermatozoides es posible gracias a la relativa diferencia existente en el tamaño entre ambos cromosomas, ya que el cromosoma X contiene más ADN que el cromosoma Y.

            Para medir la cantidad de ADN en cada célula espermática, los espermatozoides se incuban con el fluorocromo Hoechst 33342 durante un determinado tiempo a 34ºC. Este fluorocromo se une a las regiones ricas en tiamina y adenosina, y al ser “no intercalante”, se ha demostrado que no es demasiado dañina para el espermatozoide si se maneja adecuadamente. Posteriormente, los espermatozoides se tiñen con un colorante alimentario que mitigará la fluorescencia de los no viables, con lo cual sólo se separaran las poblaciones de espermatozoides vivos. A continuación, el semen teñido pasa a través de la máquina de FACS en una concentración muy baja y con una presión específica (40-50 psi) hasta que alcanza la punta de la boquilla, donde se orienta la cabeza de cada espermatozoide, de forma que el láser de argón quede perpendicular a su cara mayor. La exposición de cada uno de los espermatozoides hacia ese haz de luz induce la máxima fluorescencia del ADN teñido con Hoechst, que se recoge en detectores de 0º y detectores de 90º, por lo que únicamente los espermatozoides bien orientados se podrán analizar. El detector de 0º analiza la orientación de los espermatozoides, mientras que el de 90º analiza las diferencias de ADN. Generalmente, los sorters convencionales están configurados de manera que el detector de fluorescencia es perpendicular al haz de luz del láser (90º), para poder separar células espermáticas, se realizó una modificación que consistía en la colocación de un detector de fluorescencia hacia delante, en lugar del detector de dispersión de luz que es estándar para los sistemas de flujo ortogonales configurados. Esta modificación es necesaria para poder recoger la luz fluorescente tanto del borde de la cabeza del espermatozoide (90º), como del lado aplanado (0º). Una vez que el ADN ha sido examinado, un cristal piezoeléctrico interrumpe el flujo para crear gotas individuales, en las que va un solo espermatozoide. Cada una de estas gotas se carga eléctricamente y al pasar por una placa deflectora, las gotas que contienen espermatozoides X (cargados positivamente) irán dirigidos a la placa deflectora cargada negativamente y viceversa para los espermatozoides Y (cargados negativamente) (Fig. 1) (L. a. Johnson 2000). Los espermatozoides que no se hayan cargado adecuadamente, que estén mal orientados o que no tengan fluorescencia, serán descartados como residuos (Morris 2011).

            La pureza de la población obtenida, de espermatozoides separados, se puede optimizar mediante diferentes velocidades de separación, de esta manera, es posible conseguir más de un 90% de pureza en la muestra. El cromosoma X es ligeramente mayor que el cromosoma Y, de manera que los resultados más rápidos y más precisos serán los obtenidos cuando se seleccionen únicamente los espermatozoides X (L. A. Johnson and Welch 1999), aunque el grado de diferenciación en la cantidad de ADN entre los cromosomas X e Y es lo que realmente influirá en la pureza y la facilidad de la división (Fig. 2).

Fig. 1. Diagrama esquemático del citómetro de flujo modificado para la separación de espermatozoides. Los espermatozoides entran a través de la aguja en un flujo continuo que orienta a los espermatozoides hacia el láser. En función de la orientación, la excitación se recoge bien en el detector de 90º, bien en el de 0º. Los histogramas representan la distribución de la fluorescencia en los distintos detectores. En el histograma c, el área entre los dos picos de separación entre los espermatozoides X e Y corresponde a una mezcla de ambos espermatozoides,  se eliminará en la papelera. Modificado de Johnson L a. Sexing mammalian sperm for production of offspring: The state-of-the-art. Anim Reprod Sci. 2000;60-61:93-107.

            En un histograma típico de separación de espermatozoides por citometría de flujo (Fig. 2) podemos observar los límites exteriores, que corresponden a ambas poblaciones de espermatozoides X e Y, que permanecen constantes en todas las especies de mamíferos, mientras que en los límites interiores (área A), en los que la separación entre X e Y no está clara (B)  se descartaran. Este área B, va a variar en función de la diferencia en el contenido de ADN en los diferentes cromosomas y de la velocidad a la que se produzca la separación. Si se aumenta la velocidad de separación, el área B se verá aumentada también, reduciendo el número de espermatozoides separados (L. A. Johnson and Welch 1999).

Fig. 2. Modificado de Johnson LA, Welch GR. Sex preselection: high-speed flow cytometric sorting of X and Y sperm for maximum efficiency. Theriogenology. 1999;52(8):1323-1341.

Factores que influyen en la división de los espermatozoides

        Se utiliza el término “sortability” en inglés para definir la capacidad de la muestra de semen para ser dividida en poblaciones de espermatozoides X e Y (L. A. Johnson and Welch 1999). Ésta capacidad es variable entre especies, razas e individuos, ya que existen diferencias en el contenido de ADN en los espermatozoides, y por tanto en la proporción en el que el Hoechst 33342 se une al ADN  del núcleo de un espermatozoide X y del núcleo de un Y (Fig. 3) (L. a. Johnson 2000).

        

Fig. 3. Representación de histogramas típicos de varias especies de mamíferos en los que se observa las diferencias en contenido de ADN entre los espermatozoides X e Y. Generalmente, a mayor diferencia (ej. la Chinchilla, cuya diferencia es del 7,5%), más fácilmente obtendremos muestras de gran pureza, comparándolo con el humano, cuya diferencia en el contenido de ADN es del 2,8%, que es más difícil de separar. Modificado de Johnson L a. Sexing mammalian sperm for production of offspring: The state-of-the-art. Anim Reprod Sci. 2000;60-61:93-107.

            Para que la muestra quede bien separada, no sólo es importante la diferencia en  el contenido de ADN entre los dos tipos de espermatozoides, sino que también existen diferencias importantes en la morfología de la cabeza del espermatozoide tanto en tamaño como en área, entre las distintas especies de mamíferos, lo cual también va a influir en la capacidad de división de la muestra y en la pureza final. Aquellos espermatozoides con cabeza más aplanada y ovalada serán más fáciles de orientar en el “sorter” usando la hidrodinámica que aquellos gametos con una forma  más redondeada o angular. La diferencia de contenido en ADN y la forma de la cabeza permiten definir un “índice de divisibilidad” para cada especie, siendo aquellas que poseen dicho índice más elevado, las más fáciles de separar (Fig. 4) (Garner 2006). Esto indica que los espermatozoides más fáciles de separar en el citómetro de flujo (“Cell Sorter”) son los del toro, ya que el área de la cabeza del espermatozoide es de 34,5 μm² y la diferencia en el contenido de ADN entre los espermatozoides X e Y es del 3,8%, cuya multiplicación nos proporciona el índice de divisibilidad más alto de todos, con 131.

Fig. 4. Representación de diferentes cabezas de espermatozoides de distintas especies. El índice de divisibilidad (Sorting Index, b) corresponde a la multiplicación del área de la cabeza por la diferencia en el contenido de ADN. Modificado de Garner DL. Flow cytometric sexing of mammalian sperm. Theriogenology. 2006;65(5 SPEC. ISS.):943-957.

Según el diagrama anterior, tanto los espermatozoides del caballo como los del hombre tendrían los índices de divisibilidad más bajos de todos.

Las mayores purezas de separación en sémenes sexados debieran obtenerse cuando la diferencia total de ADN entre los espermatozoides X e Y es superior al 3,5%.  Aunque la diferencia en el contenido de ADN en los caballos es del 3,7%, mucho menor que por ejemplo en carneros, que es del 4,2%, y además el tamaño de la cabeza es inferior,  lo que supone tasas de separación para la especie equina de 1000 espermatozoides/min, comparados con los 4000-5000 obtenidos en carneros (Morris 2005).

Sexado espermático en Equinos

            Desde la producción de la primera descendencia viva procedente de semen sexado en conejos, se han obtenido crías vivas de numerosas especies por este método, incluida la equina. Sin embargo, la concentración de espermatozoides obtenidos por sexado en un caballo viene siendo del orden de 8 x 10⁵ espermatozoides/ml, lo que supone una dilución extrema que reduce considerablemente las concentraciones de plasma seminal y antioxidantes que se necesitan para mantener la estabilidad de la membrana plasmática. Para evitar los efectos perjudiciales de la sobre-dilución, la mayoría de los protocolos de “sorting” incluyen la recogida de los espermatozoides, una vez que la muestra ha sido procesada,  en un medio concentrado que contiene yema de huevo. Posteriormente se realizará una centrifugación suave para concentrar un poco la muestra y se resuspenderá en el medio adecuado, dependiendo de si la muestra va a ser utilizada en fresco, refrigerado o congelado(C. M. Balao da Silva et al. 2013; Buchanan et al. 2000; Clulow et al. 2008; Clulow et al. 2010; Clulow et al. 2009; Morris 2005)

            El primer potro nacido vivo a partir de semen sexado se consiguió gracias a la inseminación directa mediante cirugía, de dicho semen en el oviducto de una yegua, con una concentración de 50000 espermatozoides. Aunque desde entonces se han utilizado métodos menos invasivos para la inseminación con bajas dosis de espermatozoides (Morris 2011), los resultados obtenidos en fertilidad en la especie equina son inferiores a los de otras especies.

Ambos factores, la menor fertilidad del semen sexado y la eficiencia reducida del proceso de separación, han retrasado la comercialización de esta tecnología en el caballo, comparado con la industria ganadera (Gibb et al. 2011).

Como consecuencia de la obtención de estas concentraciones tan bajas de espermatozoides, Buchanan, y colaboradores (Buchanan et al. 2000) de la Universidad de Colorado, desarrollaron una técnica de inseminación profunda para depositar el semen en la punta del cuerno uterino ipsilateral a la inminente ovulación, con el objetivo de evitar el paso de los espermatozoides por todo el tracto reproductivo sin la necesidad de utilizar técnicas quirúrgicas. Posteriormente, se modificó esta técnica mediante la utilización de la histeroscopia para depositar la dosis seminal justo en la papila oviductal, lo cual permitió utilizar dosis inseminantes mucho más bajas, del orden de 1-10 x 10⁶ espermatozoides, que permitieron igualar las tasas de gestación obtenidas por inseminación convencional con semen no sexado (Morris 2011).

Aunque la necesidad de elevadas dosis inseminantes se superó con el desarrollo de la técnica anterior, el problema de la baja resolución durante proceso de separación sigue siendo un inconveniente para el sexado del semen equino. Se baraja que esta dificultad se debe en parte al pequeño tamaño de la cabeza del espermatozoide equino,  y en parte, a la necesidad de utilizar diluyentes a base de leche desnatada tanto para el manejo, como para el transporte y la criopreservación. Los componentes de la leche desnatada son necesarios como fuente de proteína y mantienen la fertilidad del semen equino de manera muy eficiente, sin embargo, proporcionan una opacidad al medio que podría interferir con la excitación del Hoechst por el láser de argón, la transmisión de la luz hacia los detectores y la uniformidad de la tinción. Se ha intentado en numerosas ocasiones, reemplazar esta fuente de proteínas por otra, como por el ejemplo el BSA (albúmina sérica bovina) que permita obtener medios más claros y transparentes, sin embargo, no se han conseguido los mismos niveles de fertilidad con ninguna otra (Gibb et al. 2011). En el año 2012 se llevó a cabo un experimento, realizado por compañeros de la Universidad de Extremadura, en el que se  evaluó el daño producido por la tinción con Hoechst 33342 en el espermatozoide equino. El estudio concluyó que los efectos negativos de la tinción eran dosis y tiempo dependientes. También concluyó que se podían minimizar estos efectos deletéreos si se usaba, durante el procesado de la muestra, una modificación del diluyente comercial INRA96 (IMV, L’Aigle, France), al que adicionaron medio Tyrodes, en lugar del diluyente utilizado en casi todos los estudios previos (diluyente Kenney modificado con medio Tyrodes). Sin embargo tanto el INRA96 como el Kenney siguen siendo diluyentes constituidos a base de leche desnatada, con lo que se sigue confiriendo a la muestra a analizar una apariencia opaca (C. Balao da Silva et al. 2012).

Además, en la mayoría de los casos, es de suponer que el laboratorio especializado equipado con el citómetro de flujo adaptado para el sexado de espermatozoides va estar a cierta distancia del semental cuyo esperma queremos sexar o de la yegua que queremos inseminar, por lo que para la introducción de esta tecnología en la industria equina a nivel comercial, tendremos la necesidad de transportar tanto el semen antes de la realización de la técnica, como después. Para ello se realizaron varios estudios en los que se demostró que la temperatura óptima de refrigeración para el transporte del semen una vez extraído es de 15ºC y que si no transcurrían más de 18 horas de la obtención hasta que se realizaba el sorting, la fertilidad de dicho semen no disminuía, obteniéndose unas tasas de gestación del 72% (Lindsey et al. 2005).

 Resuelto el problema de la distancia del semental, quedaría por resolver la distancia a la que tiene que estar la yegua del citómetro para la inseminación con el semen sexado obtenido. Se realizó un estudio que demostró que la motilidad progresiva del semen sexado disminuía considerablemente a las 48 horas cuando se refrigeraba tanto a 4ºC como a 20ºC, sin embargo, tanto la motilidad como la integridad del acrosoma no se veían seriamente afectadas si se conservaba dicho semen a 20ºC durante 12 horas, con lo que sería posible transportar dicho semen a cierta distancia (de no más de 12 horas) de la yegua que se va a inseminar (Morris 2005). Teniendo en cuenta esto, el desarrollo de protocolos fiables de congelación de semen sexado facilitaría enormemente la comercialización de esta tecnología. En las especies animales de producción, como son el toro o el carnero,  se utilizan los protocolos convencionales de congelación para el semen sexado, obteniendo resultados bastante buenos. Sin embargo, en el semen de caballo, aunque se han probado numerosos protocolos con diferentes diluyentes, la fertilidad del semen sexado congelado-descongelado es aún bastante baja, condicionando bastante el uso de dicha tecnología a nivel comercial.

            En resumen, mientras que en otras especies el sexado de espermatozoides es ya una realidad comercial,  la especie equina está todavía muy por detrás, debido al bajo rendimiento de los actuales citómetros de flujo, que desechan una gran cantidad de espermatozoides durante el proceso de separación. A esto hay que añadir el inconveniente de la necesidad de disponer de un gran  número de espermatozoides para constituir una dosis inseminante en el caballo, comparado con otras especies, y la limitada capacidad del semen equino a los procesos de congelación, que constituyen importantes limitaciones en el desarrollo de esta tecnología en esta especie (C. M. Balao da Silva et al. 2013).

            Todo el procedimiento de sexado, expone a la célula espermática a condiciones extremas que comprometen su viabilidad, como son: unas tasas de dilución realmente bajas, tiempos prolongados a temperatura ambiente,  tinción de ADN, excitación con un láser de argón,  altas presiones (40-50 psi),  diferentes medios y tampones en diferentes etapas del procedimiento, centrifugación y temperaturas de incubación variables a lo largo de todo el proceso (transporte, incubación durante la tinción, congelación y descongelación). Finalmente, los espermatozoides deben transitar por el tracto genital femenino antes de la fertilización y además deben tener capacidad fecundante. Por lo tanto, cualquier modificación que permitiera aumentar el número de espermatozoides sexados y reducir la variabilidad y la duración de las distintas etapas del procedimiento, debería mejorar la eficiencia y la productividad de la técnica (Morris 2011).

Asimismo, es bien conocida la heterogeneidad en la calidad del eyaculado entre sementales, debido a la existencia de una gran variabilidad individual,  lo que va a afectar a la capacidad de separación de los espermatozoides. Se ha estipulado que se podría predecir la capacidad de un semen para ser sexado, en base a las características individuales de cada eyaculado antes de realizar el procedimiento, lo que ayudaría a reducir los costes de la técnica evitando transportar,  almacenar y procesar aquellos eyaculados de muy mala calidad (Clulow et al. 2009).

Conclusión

El desarrollo de la técnica de inseminación con baja dosis de espermatozoides mediante video-endoscopio ha hecho posible la aplicación de la tecnología de sexado espermático en la especie equina, sin embargo, quedan aún muchos puntos por resolver para hacer que este procedimiento sea viable comercialmente.  El bajo número de espermatozoides obtenidos al final del proceso, su reducida fertilidad, y la baja capacidad para ser congelado, hacen que sea una técnica cara y poco práctica. En cuanto al aspecto productivo, se disminuye considerablemente la tasa de gestación al final de una estación reproductiva, cuestión que va a hacer replantearse seriamente a un propietario de un caballo la utilización de la técnica, ya que la obtención de animales de cualquier sexo siempre le va a suponer un beneficio económico mucho mayor que no obtener ninguno.

Para maximizar la calidad del semen sexado y poder introducirlo en la industria equina de forma comercial, la empresa que posee la patente de esta tecnología (Sexing Technologies, Navasota, TX) debería establecer un programa de investigación bien controlado con el objetivo de determinar los efectos nocivos de los diferentes pasos del procedimiento, ya que con la metodología actual se pueden enviar dosis de semen diluido al centro especializado para realizar la separación, pero las yeguas que se quieren inseminar con esas dosis sexadas deben estar cerca de dicho centro debido a baja capacidad que tiene el semen sexado equino para ser congelado, lo que supone un factor muy limitante a la hora de comercializar la técnica (Samper et al. 2012).

Referencias

Balao da Silva, C, B Macías-García, A Morillo Rodriguez, J M Gallardo Bolaños, J A Tapia, I M Aparicio, J M Morrell, H Rodriguez-Martínez, C Ortega-Ferrusola, and F J Peña. 2012. “Effect of Hoechst 33342 on Stallion Spermatozoa Incubated in KMT or Tyrodes Modified INRA96.” Animal Reproduction Science 131 (3-4): 165–71. doi:10.1016/j.anireprosci.2012.01.003.

Balao da Silva, C. M., C. Ortega Ferrusola, a. Morillo Rodriguez, J. M. Gallardo Bolaños, M. Plaza Dávila, J. M. Morrell, H. Rodriguez Martínez, J. a. Tapia, I. M. Aparicio, and F. J. Peña. 2013. “Sex Sorting Increases the Permeability of the Membrane of Stallion Spermatozoa.” Animal Reproduction Science 138 (3-4): 241–51. doi:10.1016/j.anireprosci.2013.02.021.

Buchanan, B R, Seidel, G.E., Mc Cue, P.M., Schenk, J.L., Herickhoff, L.A. and Squires, E.L. 2000. “Insemination of Mares with Low Numbers of Either Unsexed or Sexed Spermatozoa.” Theriogenology 53 (00): 1333–44. doi:10.1016/S0093-691X(00)00276-4.

Clulow, J R, H Buss, H Sieme, J a Rodger, a J Cawdell-Smith, G Evans, D Rath, L H a Morris, and W M C Maxwell. 2008. “Field Fertility of Sex-Sorted and Non-Sorted Frozen-Thawed Stallion Spermatozoa.” Animal Reproduction Science 108 (3-4): 287–97. doi:10.1016/j.anireprosci.2007.08.015.

Clulow, J R, G Evans, W M C Maxwell, and L H a Morris. 2010. “Evaluation of the Function of Fresh and Frozen-Thawed Sex-Sorted and Non-Sorted Stallion Spermatozoa Using a Heterologous Oocyte Binding Assay.” Reproduction, Fertility, and Development 22 (4): 710–17. doi:10.1071/RD09033.

Clulow, J R, G Evans, L H a Morris, and W M C Maxwell. 2009. “Factors Influencing the ‘Sortability’ of Stallion Spermatozoa into X- and Y-Chromosome Bearing Populations.” Animal Reproduction Science 113 (1-4): 220–28. doi:10.1016/j.anireprosci.2008.08.019.

Garner, Duane L. 2006. “Flow Cytometric Sexing of Mammalian Sperm.” Theriogenology 65 (5 SPEC. ISS.): 943–57. doi:10.1016/j.theriogenology.2005.09.009.

Gibb, Z., L. H a Morris, W. M C Maxwell, and C. G. Grupen. 2011. “Use of a Defined Diluent Increases the Sex-Sorting Efficiency of Stallion Sperm.” Theriogenology 75 (4). Elsevier Inc.: 610–19. doi:10.1016/j.theriogenology.2010.10.001.

Gledhill, B L, S Lake, L L Steinmetz, J W Gray, Crawford, P N Dean, and M A Van Dilla. 1976. “Flow Microfluorometric Analysis of Sperm DNA Content: Effect of Cell Shape on the Fluorescence Distribution.” Journal of Cellular Physiology 87 (3). Wiley Subscription Services, Inc., A Wiley Company: 367–75. doi:10.1002/jcp.1040870312.

Johnson, L A, and D Pinkel. 1986. “Modification of a Laser-Based Flow Ctyometer for High Resolution DNA Analysis of Mammalian Spermatozoa.” Cytometry 7: 268–73.

Johnson, L A, and G R Welch. 1999. “Sex Preselection: High-Speed Flow Cytometric Sorting of X and Y Sperm for Maximum Efficiency.” Theriogenology 52 (8): 1323–41. doi:10.1016/S0093-691X(99)00220-4.

Johnson, L. a. 2000. “Sexing Mammalian Sperm for Production of Offspring: The State-of-the-Art.” Animal Reproduction Science 60-61: 93–107. doi:10.1016/S0378-4320(00)00088-9.

Lindsey, a C, D D Varner, G E Seidel, J E Bruemmer, and E L Squires. 2005. “Hysteroscopic or Rectally Guided, Deep-Uterine Insemination of Mares with Spermatozoa Stored 18 H at Either 5 Degrees C or 15 Degrees C prior to Flow-Cytometric Sorting.” Animal Reproduction Science 85 (1-2): 125–30. doi:10.1016/j.anireprosci.2003.11.008.

Morris, Lee H a. 2005. “Challenges Facing Sex Preselection of Stallion Spermatozoa.” Animal Reproduction Science 89 (1-4 SPEC. ISS.): 147–57. doi:10.1016/j.anireprosci.2005.06.024.

Morris, Lee H a. 2011. “Sex-Sorted Spermatozoa.” In Equine Reproduction, edited by Angus O. McKinnon, Edward L. Squires, Wendy E. Vaala, and Dickson D. Varner, 2nd Ed, 3042–48. Wiley-Blackwell.

Samper, Juan C., Lee Morris, Fernando J. Peña, and Tracy a. Plough. 2012. “Commercial Breeding with Sexed Stallion Semen: Reality or Fiction?” Journal of Equine Veterinary Science 32: 471–74. doi:10.1016/j.jevs.2012.06.018.

Pilar Nieto Olmedo

Laura García Sánchez

Máster en Biología y Tecnología de la Reproducción de la Universidad de Oviedo

Curso 2015-2016