CONSERVACIÓN DE DELFINES: NUEVAS ESTRATEGIAS PARA UN MEJOR USO DEL SEMEN SEXADO Y LAS TÉCNICAS DE REPRODUCCIÓN ASISTIDA

La predeterminación del sexo es un medio atractivo para controlar la proporción de sexos en una población determinada de animales de producción o de la fauna salvaje. El sexado de espermatozoides de mamíferos mediante citometría de flujo para su uso en inseminación artificial (IA) o fecundación in vitro (IVF) ha dado lugar al nacimiento de cientos de miles de descendientes en numerosas especies y sigue siendo el único método científicamente probado para la selección del sexo en el momento de la concepción. El sexado del semen se puede realizar debido a la diferencia en el contenido de ADN total entre los espermatozoides que llevan el cromosoma X (de mayor tamaño) y los que llevan el cromosoma Y (más pequeño). Para lograr la selección, los espermatozoides se tiñen con un colorante que permite que el citómetro de flujo detecte la diferencia de ADN y separarlos en dos poblaciones distintas. En casos como el del toro, el esperma con el sexo seleccionado suele ser criopreservado para su posterior utilización en IA. En referencia a las vacas lecheras, donde interesa sexar el esperma con el fin de obtener un mayor número de hembras (productoras de leche), existen discrepancias entre: las ventajas de la determinación del sexo, el método por el cual los espermatozoides son sexados y los efectos del proceso de clasificación en la viabilidad de los espermatozoides y la fertilidad. Se discuten además las distintas vías por las cuales semen sexado puede ser difundido, así como el estado del esperma después de someterlo a técnicas de criopreservación.

El uso de espermatozoides seleccionados en función del sexo representa una importante ayuda para la recuperación de pequeñas poblaciones de animales, sesgando la población hacia hembras para poder producir más individuos de la especie. Además, en poblaciones en las cuales la proporción de uno de los sexos pueda dejar en desventaja al otro, este problema puede verse solucionado mediante esta técnica de selección. A pesar de estas ventajas de estabilidad reproductiva y social de los programas de IA utilizando espermatozoides sexados y la eficacia demostrada de estas tecnologías en el delfín mular (Tursiops truncatus) comprobadas en múltiples acuarios, la falta de experiencia y los gastos asociados con el proceso de clasificación han frenado su uso. Sería interesante que se ofrecieran más oportunidades en zoológicos para poder mejorar la técnica y ampliar conocimientos. Por otro lado, la disminución en los costes de producción se basa en la disminución de la dosis mínima efectiva para la inseminación. Actualmente, en el caso del delfín mular, se recomienda usar 200 millones de espermatozoides con motilidad progresiva. En otras especies ya se había logrado disminuir la dosis de IA utilizando otro tipo de técnicas de inseminación intrauterinas. Estos métodos se basan en el uso de un endoscopio o un catéter diseñado para depositar el semen cerca o en la misma unión Útero-tubárica (UTJ), en lugar de hacerlo en el cuerno uterino caudal como en la IA convencional.

El sexado por citometría de flujo es un proceso de separación basado en la diferencia en la cantidad de ADN entre los cromosomas X e Y [4]. La diferencia en el contenido de ADN entre los espermatozoides bovinos que llevan el cromosoma X es 3,8% más con respecto al cromosoma Y [3]. En humanos esta diferencia es de un 2,8% y en la mayoría de los mamíferos están en el rango de 3-4,5 % aproximadamente [13]. El cromosoma X es mayor que el Y debido a una mayor cantidad de cromatina heteróloga.

El proceso consiste en el paso de espermatozoides a través de un detector como el citómetro de flujo el cual mide la intensidad de fluorescencia resultado de la excitación de las moléculas de colorante ligado al ADN. Usualmente es generado por un láser y la intensidad de fluorescencia obviamente depende del número de moléculas fluorescentes unidas al DNA [9].

FIGURA 1. ESQUEMA BÁSICO DEL FUNCIONAMIENTO DE UN CITÓMETRO DE FLUJO

 

La intensidad de la luz UV afecta al ADN de los espermatozoides, específicamente a la motilidad de los espermatozoides. En un estudio se uso el colorante Hoeschst 33242. Éste colorea el ADN de manera eficiente y causa menor daño tanto a la morfología como a la motilidad del espermatozoide ya que reduce la intensidad a la que actúa el láser [11].

Un factor negativo de la técnica es la cantidad de espermatozoides que se ven dañados durante el proceso, que fluctúa en torno al 70% de los espermatozoides, que fallan al ser clasificados debido al daño o por la ausencia de distinción al pasar por el citómetro [7]. Además, el campo electrostático, al que se ven sometidos, les produce varios daños como pueden ser: la creación de poros en la membrana, disminuyendo así su capacidad de fecundación,una mayor formación de especies reactivas de oxigeno (ROS), dañando aún más sus membranas, y defectos en la cola, afectando a su motilidad.

Una de las mayores limitaciones de la citometría de flujo es la tasa de clasificación, lo que significa que animales inseminados con semen sexado tienden a recibir menor concentración de espermatozoides por dosis que los animales que experimentan una IA con semen entero. El número de espermatozoides utilizado en la práctica habitual es de 20 x 10⁶ espermatozoides por dosis.

FIGURA 2. EJEMPLAR TURSIOPS TRUNCATUS

En este artículo nos vamos a centrar en el estado actual de la tecnología de separación del semen en la naturaleza, haciendo hincapié a las implicaciones en la gestión y conservación de las especies, centrándonos sobre todo en el delfín mular (Tursiops truncatus).

Exceptuando el volumen de la cabeza del espermatozoide, la única diferencia entre poblaciones de espermatozoides que pueda ser medible y científicamente válida es el contenido de ADN. Como ya hemos mencionado, el cromosoma X de los mamíferos tiene más ADN que el cromosoma Y, siendo esta diferencia la base para la separación de los espermatozoides por citometría de flujo. La técnica analiza cuantitativamente el contenido de ADN y proporciona un método fiable para la identificación y separación de las poblaciones de espermatozoides X e Y. La pureza de más del 90% del sexo deseado se puede lograr utilizando la tecnología de clasificación de esperma actual. El desarrollo de los citómetros de flujo de alta velocidad (MoFlo ^® SX, Dako, Fort Collins, CO, USA) y la mejora de los sistemas de orientación celular ha dado lugar a grandes aumentos en la eficiencia de la clasificación y calidad del esperma.

El uso de la citometría de flujo para sexar espermatozoides frescos y obtener descendencia del sexo determinado se realizó por primera vez en conejos por el equipo de LA. Johnson en 1989. Desde entonces la técnica ha avanzado mucho y se han obtenido descendiente utilizando semen sexado en fresco o congelado, asociándolo a las técnicas de reproducción asistida (TRA) en humanos y en animales(tanto domésticos como es especies salvajes en peligro de extinción). En la especie que nos interesa, el primer delfín mular nació en el año 2005 a cargo del equipo de J.K. O’Brien y T.R Robeck. Ellos llevaron a cabo una investigación para desarrollar la clasificación del semen y metodologías de conservación novedosas para la predeterminación del sexo en el delfín  mular, utilizando la IA. Realizaron varios estudios en los que comprobaron: el efecto que tiene el plasma seminal, la concentración de espermatozoides y la velocidad de congelación en la calidad de los espermatozoides in vitro.

Durante más de treinta años se han estado buscando herramientas para garantizar la sostenibilidad a largo plazo de la población ex situ de delfines mulares. Las TRA son un componente clave de este grupo de herramientas de gestión e incluyen la congelación de semen, inseminación artificial (IA) y la preselección del sexo mediante citometría de flujo.

Se llevó a cabo un estudio para tratar de probar este sistema en la especie de delfines Tursiops truncatus.  Los objetivos de la investigación eran:

·          Desarrollar y describir los métodos de para realizar la IA (profundidad de deposición del semen, el sexado, las dosis).

·          Comparar la calidad espermática diferenciando el semen sexado y el no sexado.

·          Examinar las tasa de embarazo y los partos obtenidos mediante la realización de IA por medio de tres grupos (semen no sexado, semen sexado en pequeña dosis, semen sexado usando la dosis estándar).

En el estudio utilizaron una muestra de 39 hembras obtenidas de diferentes centros zoológicos del mundo que tenían edades mayores de 6 años y pesaban menos de 180 kg. Por otro lado, el tamaño muestral de macho fue de 12, también recogidos de distintas zonas del mundo, y las edades estaban comprendidas entre los 10 y 35 años, con pesos menores a 200 kg. Se alojaron a los individuos en unas piscinas especiales y fueron alimentados de acuerdo a su peso corporal.

Se realizó un seguimiento endocrino recogiendo las muestras de orina. Se siguieron: el estudio de LH (mediante inmunoensayo EIA por análisis retrospectivos), creatinina, conjugados de estrógenos urinarios (mediante ensayo enzimático), y progesterona.
Se intentó además sincronizar el día de la ovulación para programar la IA de la manera más adecuada. Mediante ecografía se vio en detalle la actividad folicular y después se usó para confirmar el embarazo.Los varones fueron capacitados para la eyaculación. Se analizó: la concentración, volumen, motilidad espermática y la integridad de la membrana plasmática utilizando técnicas estandarizadas [6]. Las suspensiones de esperma de cada macho se diluyeron a 200-400 x 10⁶ espermatozoides/ml con medio HEPES-TALP, añadiendo antibiótico (sulfato de estreptomicina) y sometiéndolo a incubación.  Mediante citometría de flujo de alta velocidad fueron obteniendo la separación de los espermatozoides portadores de cromosoma X y portadores de cromosoma Y. Posteriormente se criopreservaron y descongelaron para su uso. Por otro lado, el semen no sexado también fue criopreservado y posteriormente descongelado utilizando bolitas o pajuelas de 0,5ml.

Para la inseminación artificial se tuvo que tratar con diazepan a las hembras para tranquilizarlas. La inseminación fue el paso más complicado del proceso, ya que se encontraron con muchas barreras anatómicas como el pliegue espermatecal (pseudocérvix),  el orificio cervical externo, el orificio cervical interno, la bifurcación uterina y la UTJ.

Las deposiciones del semen que se realizaron fueron:

·          Semen no sexado (gran dosis) depositado en el cuerno uterino, en 9 de las hembras.

·          Semen sexado (dosis estándar) depositado a la mitad del camino dentro de uno o ambos cuernos uterino, en 20 hembras.

·          Semen sexado (pequeña dosis)  concentrado por centrifugación después de su descongelación y depositado en UTJ, en 20 hembras.

Se diagnosticó un embarazo a los 28 días post-IA determinando la concentración de progesterona (superior a 5 ng /ml). Después, se realizaron ecografías para la confirmación y seguimiento de la preñez.

FIGURA 3. BARRERAS ANATÓMICAS VAGINALES
 ENCONTRADASAL REALIZAR LA INSEMINACIÓN [1]

Se encontraron con muchas barreras anatómicas importantes  durante los procedimientos de inseminación que incluyen el pliegue espermatecal (pseudocervix), orificio cervical externo, orificio cervical interno, bifurcación uterina y la UTJ. El paso a través del orificio cervical representó la parte más complicada del procedimiento. 

TABLA 1. EDAD, CARACTERÍSTICAS DEL CICLO ESTRAL Y PARÁMETROS REPRODUCTIVOS
DEL DELFÍN NARIZ DE BOTELLA (TURSIOPS TRUNCATUS) [1]

Entre los resultados que se encontraron se vieron diferencias significativas en la profundidad de la inseminación, en la concentración de espermatozoides utilizada y en el volumen total de la suspensión en los tres grupos.Por el contrario, no se vieron diferencias en cuanto a la tasa de clasificación del esperma, la pureza ni respecto a los métodos de criopreservación. Las tasas de embarazo fueron más o menos parecidas entre los distintos tratamientos, y en todos los tratamientos la tasa de edad afectó a los resultados.

Este estudio sirvió para examinar los factores que afectan a la fertilización en el delfín  mular con espermatozoides sexado y no sexados. Permitió también obtener nuevos datos acerca de la anatomía reproductiva y de perfiles endocrinos que ayudaron a perfeccionar las bases de datos sobre esta especie.

Para delfines menores de 25 años, la tasa de embarazo se mantuvo incluso cuando se reducía cuatro veces la dosis de semen sexado usado en la IA y, teniendo en cuenta además, el lugar de deposición.  Son necesarios aun más estudios para poder confirmar con mayor seguridad que puede haber tasas de embarazo con bajas dosis de semen sexado.Se consiguió el nacimiento de 11 crías, habiendo sido obtenidas el 91% de ellas a partir de semen sexado, lo que pone de manifiesto la eficacia de la citometría de flujo como una herramienta adecuada para el mantenimiento de la ratio de sexos en poblaciones de delfín mular.
Aunque la senescencia reproductiva o disminución del éxito reproductivo con la edad se ha demostrado en delfines y otras especies de mamíferos, la contribución de aborto espontáneo a esta disminución se ha documentado recientemente y con esta investigación se ha vuelto a confirmar. En un estudio retrospectivo, se vio que mujeres sometidas a FIV que eran mayores de 35 años tenían casi el doble de incidencia de aborto espontáneo (35%) que las mujeres menores de 35 (22%) [8].  En vacas también hay estudios que corroboran estos resultados. Se cree que un factor clave para esta pérdida es la baja funcionalidad del cuerpo lúteo, que resulta en la secreción inadecuada de progesterona para el desarrollo de las glándulas secretoras, lo cual es esencial para sostener al embrión temprano. La suplementación con progesterona durante las primeras etapas del embarazo es una práctica muy común en la clínica humana y en algunas especies domésticas, ya que está considerada como un buen método para combatir los abortos en las etapas tempranas.

 Los resultados de este estudio demuestran la eficacia de la selección de esperma y la IA para la gestión de proporción de sexos en las poblaciones de delfines mulares.Las tasas de embarazo son mayores con espermatozoides sexados. Esto podrá reducir costes en la producción de crías de sexo deseado y mejorar el manejo de esta técnica en las poblaciones de delfines.

    La reducción de las tasa de aborto en hembras menores de 25 años nos indica que es adecuado seleccionar las hembras a las que se les va a realizar la IA para aumentar así la eficacia de los programas utilizando los espermatozoides sexados.

FIGURA 4. EJEMPLAR DE DELFÍN (TURSIOPS TRUNCATUS) CON SU CRÍA

Isabel Gutiérrez Díaz

Isabel M Sánchez Castelló

BIBLIOGRAFÍA

1. Robeck, T. R. et al. Development and evaluation of deep intra-uterine artificial insemination using cryopreserved sexed spermatozoa in bottlenose dolphins (Tursiops truncatus). Anim. Reprod. Sci. 139, 168–181 (2013).

2. O’Brien, J. K. & Robeck, T. R. The relationship of maternal characteristics and circulating progesterone concentrarions with reproductive outcome in the bottlenose dolphin (Tursiops truncatus) after artificial insemination, with and without ovulation induction, and natural breeding. Theriogenology, 78, 469-482 (2012)

3. O’Brien, J. K., Steinman, K. J. & Robeck, T. R. Application of sperm sorting and associated reproductive technology for wildlife management and conservation. Theriogenology 71, 98–107 (2009).

4. Grant V, Chamley L. Sex-Sorted Sperm and Fertility: An alternative view. Biol Reprod.,76, 184-188 (2007)

5. O’Brien, J. K. & Robeck, T. R. Development of sperm sexing and associated assisted reproductive technology for sex preselection of captive bottlenose dolphins (Tursiops truncatus). Reprod. Fertil. Dev. 18, 319–329 (2006).

6. Robeck T.R et al. Estrous cycle characterisation and artificial inseminaton using frozen-thawed spermatozoa in the bottlenose dolphin (Tursiops truncatus). Reproduction, 129, 659-674 (2005)

7. Weigel K. Exploring the role of sexed semen in dairy production systems. J. Dairy Sci. 87, 120-130 (2004)

8. Rochebrochard E., Thonneau P. Paternal age and maternal age are risk factors for miscarriage; results of muticentre European study. Hum. Reprod, 17, 1649-1656 (2002)

9. Garner D, Seidel Jr. Current Status of Sexing Mammalian Spermatozoa, Reproduction 124, 733-743 (2002)

1

10. Brook F.M . Ultrasonographic imaging of the reproductive organs of the female bottlenose dolphin, Tursiops truncatus aduncas. Reproduction, 121, 419-428 (2001).

11. Garner D. Sex-Sorting Mammalian Sperm: Concept to Application in Animals. J
Andrology. 22, 4 (2001).

12. Mann J., Connor R.C. , Barre L.M , Heithaus M.R. . Female reproductive success in bottlenose dolphins (Tursiops sp.) : life history, habitat, provisioning, and group-size effects. Behav.Ecol. 11, 210-219 (2000)

13. Johnson L. Sexing mammalian sperm for production of offspring: the state-ofther-art.  Anim Reprod Sci 60-61, 93-107 (2000).

14. L. Cornell, E. Asper, J. Antrim, S. Searles. Progress report: Results of a long-range captive breeding program for the botlenose dolphin, Tursiops truncatus gilli. Zoo Biol. 41-53 (1987)

15. H.Marsh, T. Kasuya. Evidence for reproductive senescence in female cetaceans. Rep.Int.Whal. Comn., 8, 57-74 (1986).

¿SERÁ ESTE TORO UN BUEN PADRE?

La selección de un toro adquiere una importancia económica trascendental en la explotación ganadera, ya que de él va a depender, en gran medida, el número de crías nacidas en la granja. Esta selección es un importante elemento económico porque va a tener un mayor impacto en la rentabilidad que otros factores, como pueden ser: el crecimiento de los terneros, la eficiencia alimentaria o la condición corporal de los animales.  

Los problemas de subfertilidad que pueden afectar a un toro van a acarrear una serie de consecuencias negativas para la viabilidad de la explotación como pueden ser el aumento en el intervalo entre partos, menor peso al nacimiento y mayor porcentaje de vacas desechadas cuando el fallo está en el macho.

Una buena selección es importante para detectar y descartar aquellos toros que, aunque lleguen a preñar alguna vaca, tienen fertilidad reducida porque sólo van a dejar gestantes a vacas en momentos puntuales.

Tradicionalmente se ha evaluado la capacidad reproductiva de un macho en función del porcentaje de hembras gestantes. Se debe ir más allá para lograr una selección adecuada, teniendo en cuenta más factores, y adelantándonos en la evaluación sin esperar a que el toro cubra hembras. Así se logran reducir posibles pérdidas si no es un buen semental, ahorrando en gastos de alimentación, mano de obra, etc., evitando mantener animales improductivos.

            Los momentos más indicados para evaluar a los toros serían antes de comenzar la estación reproductiva y antes de la compra del ejemplar.

¿En qué hay que fijarse para seleccionar el toro?

La capacidad reproductiva va a estar influida por un buen estado general físico y por la calidad del semen, por lo que es importante recurrir a la ayuda de un profesional a la hora de seleccionar un buen ejemplar.

El toro tendrá que cumplir unos requisitos mínimos como son: un buen estado de salud general, buena conformación y condición corporal, tamaño propio para su edad y buena movilidad. Es muy importante que los animales no tengan cojeras ni mala conformación de patas porque limitan su capacidad de monta.

La primera evaluación debe hacerse en la pubertad, observando, principalmente, el desarrollo testicular. Lo primero que hay que tener en cuenta es que los testículos hayan descendido, y una vez que comprobemos esto, mirar que el tamaño es adecuado. Con esto, se logra hacer una primera criba de animales no aptos, pero no va a ser definitiva para los que cumplan estas primeras condiciones.

Una vez que cumplen el año de edad se vuelven a evaluar, mirando que el tamaño de escroto y testículos siga siendo el recomendado para su edad y además, comprobando que no haya cicatrices u otras patologías a este nivel. El diámetro de la bolsa escrotal está relacionado con el tamaño y peso de los testículos y, por lo tanto, con la producción diaria de espermatozoides. En cuanto al pene y al prepucio hay que descartar la presencia de sangre o exudados que indiquen daños a este nivel. Se suelen estudiar en el momento de recolección del semen. También se estudia por primera vez la calidad seminal. A esta edad es importante además realizar un examen de los órganos reproductores internos, que hará el veterinario mediante una palpación rectal. Menos del 50% de los animales pasarán esta prueba si se aplican los criterios de evaluación con rigurosidad.

En cuanto a la calidad seminal, un experto evaluará una muestra de semen. Los factores básicos a examinar serán el volumen de eyaculado, la concentración de espermatozoides y su movilidad y morfología.

¿Qué problemas se pueden encontrar si no se realiza un examen al futuro semental?

            Un fallo frecuente es el de seleccionar al toro “más guapo”, sin realizar los exámenes  que hemos mencionado anteriormente y que determinarán una buena o mala capacidad reproductiva. Guiarse sólo por la belleza puede dar alguna que otra sorpresa.

            Un ejemplo curioso que hemos encontrado navegando por la red fue lo que ocurrió en febrero de 2009 en México, donde una ganadera compró a un vecino un supuesto toro semental con buena estampa. Hizo una gran inversión para después comprobar que el toro no dejaba preñadas a  sus vacas. Este caso se llevó a los tribunales, donde la compradora denunció a su vecino por fraude.  Fue tan llamativo, que la fiscalía acusó al toro de ser gay y “salir del armario” al llegar a la explotación de la compradora.

           

Con este caso lo que se ve es la importancia de realizar los exámenes previos, ya que comprar un toro requiere una gran inversión como para no obtener después buenos resultados.

Aquí en España es muy común acudir a ferias de ganado para comprar reproductores para la explotación. Lo normal es que estos ejemplares sean aptos porque ya han sido seleccionados por las asociaciones de la raza a la que pertenecen. De todos modos, no está de más que el comprador haga un examen alternativo para asegurar que el toro tenga una buena aptitud reproductiva.

A modo de conclusión, intentaremos responder a la pregunta formulada al principio ¿será este toro un buen padre? Es recomendable que se realice siempre un estudio detallado de los terneros de la ganadería que se vayan a dejar como sementales o de los machos que se vayan a comprar para incluir en la explotación como futuros reproductores. Esto se ve justificado por la gran inversión que requieren la compra o la cría de un macho y el impacto económico sobre los beneficios que tienen a largo plazo, haciendo la explotación menos rentable. La estructura de los rebaños hace que haya un macho para un alto número de vacas. Por tanto, si un toro falla se multiplica este fallo por el número de vacas. También es recomendable que se tenga un mayor número de reproductores respecto al número de vacas a servir, para no jugarse el futuro de la explotación a una sola carta.

            Tradicionalmente se han achacado los problemas reproductivos de los rebaños a las hembras. Todos los motivos explicados anteriormente hacen que haya que concienciarse y darle más importancia a los reproductores de la explotación. La reproducción es un pilar clave de las ganaderías y se le debe dar la importancia que merece, asumiendo que en ocasiones el origen de los problemas puede estar en los machos.

Bibliografía

            John P. Kastelic, Jacob C. Thundathil, Leonardo F. C. Britoc. Bull BSE and semen analysis for predicting bull fertility. Proceedings of the Society for Theriogenology 2012 Annual Conference.

            http://www.periodicoexpress.com.mx

            Apuntes de asignatura Producción Animal de 5º de Veterinaria. Facultad de Veterinaria, Universidad de Córdoba.

            Apuntes de asignatura Reproducción y Obstetricia Animal de 5º de Veterinaria. Facultad de Veterinaria, Universidad Complutense de Madrid.

Autores

            María Barros San Cristóbal

            José Daniel Jiménez Calderón

            Alicia Román Trufero

           

"Hembras al poder"

El uso del semen sexado se está convirtiendo en una realidad en nuestros días. El uso del semen sexado está cada vez más extendido, ya que nos permite obtener crías del sexo deseado. Se trata de semen que contiene espermatozoides que nos van a dar crías del sexo que nos interesa en cada momento, machos o hembras, con una eficiencia del 90%, es decir, de 100 nacidos obtendremos 90 del sexo deseado.

 Una pregunta que podría plantearse es si realmente tiene utilidad este semen sexado. La respuesta es sí. El semen sexado tiene una gran importancia en ganadería, por ejemplo, ya que nos va a permitir obtener descendientes del sexo que más interese en las distintas explotaciones ganaderas. De este modo en ganadería de vacas lecheras se utilizará semen sexado que nos dé nacimientos de hembras, que son las productoras de leche, y en la ganadería cárnica bovina se utilizará semen sexado que nos dé descendientes macho, ya que son los de mayor interés en la producción de carne. Esto acarrea una gran cantidad de beneficios económicos para las explotaciones ganaderas, ya que habrá menos nacimientos pero todos ellos serán los adecuados para el objetivo de dichas explotaciones. Pero no solo tiene aplicaciones en especies domésticas, sino que también es de mucha utilidad para especies salvajes a dos niveles: al igual que en ganadería, a nivel económico, ya que permite mejorar la eficiente utilización del escaso espacio disponible en cautividad, y a nivel de conservación de especies, ayudándonos a mantener una mayor estabilidad a nivel social, a conservar la diversidad genética y a recuperar y mantener especies en peligro de extinción.

En este artículo nos queremos centrar principalmente en la importancia del semen sexado en la conservación de especies salvajes en peligro de extinción. Las instituciones zoológicas tratan de desarrollar programas de cría para la conservación de estas especies, cuyos objetivos son la obtención de descendencia sana, poblaciones del tamaño adecuado y una relación de sexos adecuada para cada población. En estos casos la preferencia de sexos es por las hembras, ya que van a ser estas las que permitirán el nacimiento de crías en generaciones posteriores, manteniendo así a largo plazo la posibilidad de obtener crías. Pero es importante tener en cuenta que de forma natural esta situación no se va a dar, sino que existe la misma probabilidad del nacimiento de una hembra que de un macho. Por este motivo, este desequilibrio de la relación de sexos natural puede suponer algunos problemas a largo plazo para la población. De cualquier modo, aunque improbable, podría ser que la relación de machos y hembras se viera desequilibrada de forma natural beneficiando a los machos. Esta situación supondría un gran contratiempo en los programas de cría de especies en peligro de extinción. Además está el problema de que en cautividad una cantidad tan alta de machos no puede mantenerse, ya que, entre otras cosas, se produce un desequilibrio en la ordenación a nivel social de ciertas poblaciones en las que las hembras son las dominantes, así como un aumento de la competencia entre machos, peleas, agresiones… Por todas estas razones son tan importantes los programas de cría mencionados anteriormente, que deben permitir una mayor descendencia de hembras que de machos. Para conseguirlo hay que recurrir a las Técnicas de Reproducción Asistida, que nos van a permitir seleccionar a los espermatozoides deseados y conseguir embarazos para obtener la progenie deseada. Gracias al uso de estas técnicas se han conseguido nacimientos de individuos del sexo deseado en especies como conejos, cerdos, vacas, ovejas, caballos, perros, gatos, búfalos, ciervos, alces, delfines, primates humanos y no humanos, como el gorila, chimpancé, babuinos y titís.

    Pero… ¿cómo podemos obtener semen sexado? Actualmente es posible realizar la selección de sexos mediante el uso de una técnica que se basa en la distinta cantidad de ADN que presentan los cromosomas X e Y.

    El cromosoma Y es de menor tamaño que el X y por este motivo presenta una menor cantidad de ADN que él. La dotación cromosómica sexual de los machos es XY, mientras que la de las hembras es XX, por lo que si nuestro objetivo es obtener descendientes macho deberemos conseguir espermatozoides con cromosoma Y y si queremos conseguir el nacimiento de hembras debemos obtener espermatozoides con cromosoma X, ya que el óvulo va a aportar en todos los casos un cromosoma X. La técnica que nos permite realizar la separación con los mejores  resultados es la citometría de flujo, utilizando un citómetro de flujo con unas características especiales para este fin. Con esta técnica se realiza un análisis cuantitativo de los espermatozoides de una muestra para detectar la cantidad de ADN que presentan. Al pasar por el citómetro van a recibir un disparo de un rayo láser, quedando con una carga determinada en función de su cantidad de ADN. En función de esta carga, y por tanto de su cantidad de ADN, serán separados tras pasar por un campo electromagnético. Una vez separados podrán usarse en las diferentes técnica de reproducción para conseguir las crías del sexo deseado. Leer más...

    Un caso muy llamativo es el de los delfines de la especie Tursiops truncatus. Desde hace más de treinta años se llevan buscando sistemas que permitan mantener la sostenibilidad de las poblaciones de esta especie. Una de las alternativas de mayor éxito son las ya mencionadas anteriormente técnicas, en las que se ha producido un gran desarrollo, especialmente en estos delfines. Leer más...

    En los programas de conservación para esta especie se ha introducido un protocolo de conservación que consiste en la selección de los espermatozoides del sexo deseado, su congelación y su uso posterior, en el momento más adecuado, en inseminación artificial. El principal problema que se encontró a este protocolo fue el gran coste económico que suponía la obtención de una concentración de espermatozoides adecuada para conseguir unas tasas de éxito aceptables mediante la separación de espermatozoides por citometría de flujo. Además para hacer la inseminación en el útero de la hembra con esta concentración de  espermatozoides adecuada habría que introducir un gran volumen de semen en la hembra, ya que con la citometría de flujo los espermatozoides quedan separados en un gran volumen de medio, lo cual no es muy adecuado. A raíz de estos inconvenientes surgió la necesidad de encontrar un sistema que permitiera solventar estos problemas. La alternativa que se encontró pasaba por realizar la inseminación en un lugar más profundo del aparato genital femenino, aproximando de este modo los espermatozoides con el óvulo de la hembra. De este modo, haciendo la deposición del semen en la unión útero-tubárica, en lugar de en el cuerpo del útero, se podría utilizar una dosis de espermatozoides mucho más baja, hasta 10-100 veces menor, con la consecuente reducción de los costes que supone la separación de los espermatozoides, así como del volumen de semen que se introducirá en la hembra en la inseminación artificial. Científicos de Estados Unidos llevaron a cabo un estudio para tratar de demostrar que este sistema alternativo daba buenos resultados en la obtención de delfines del sexo deseado, hembras en este caso, con unos resultados bastante exitosos. Consiguieron cumplir con todos los objetivos del trabajo, que eran la obtención de hembras nacidas sanas a partir de inseminación con una dosis de semen sexado más baja que la estandarizada, consiguiendo reducir los costes del proceso. Leer más... Es importante remarcar que los resultados que se obtuvieron en este trabajo fueron mejores en hembras jóvenes, de menos de 25 años, hay que tener en cuenta que la vida de una hembra de Tursiops truncatus es de unos 40 años, mientras que los machos raramente superan los 30. A la hora de aplicar estas tecnologías sería importante tener en cuenta estos factores. 

    La selección de espermatozoides y la inseminación artificial son un sistema muy eficaz para mantener la relación de sexos en las poblaciones de delfines de la especie Tursiops truncatus. Se puede aplicar por tanto esta estrategia en los programas de conservación de esta especie, cuyas poblaciones son escasas y de este modo ayudaremos a que se mantengan.

Isabel Gutiérrez Díaz

Isabel M Sánchez Castelló

BIBLIOGRAFÍA

Espinosa-Cervantes, R., Córdoba-Izquierdo, A. 2012. « Sexing sperm of domestic animals».Tropical Animal Health and Production 45 (diciembre): 1-8.

Maxwell, W.M.C, G Evans, F.K Hollinshead, R Bathgate, S.P de Graaf, B.M Eriksson, L Gillan, K.M Morton, y J.K O’Brien. 2004. «Integration of sperm sexing technology into the ART toolbox». Animal Reproduction Science 82–83 (julio): 79-95. doi:10.1016/j.anireprosci.2004.04.013.

O’Brien, J.K., K.J. Steinman, y T.R. Robeck. 2009. «Application of sperm sorting and associated reproductive technology for wildlife management and conservation». Theriogenology 71 (1) (enero 1): 98-107. doi:10.1016/j.theriogenology.2008.09.052.

Robeck, Todd R., G.A. Montano, K.J. Steinman, P. Smolensky, J. Sweeney, S. Osborn, y J.K. O’Brien. 2013. «Development and evaluation of deep intra-uterine artificial insemination using cryopreserved sexed spermatozoa in bottlenose dolphins (Tursiops truncatus)». Animal Reproduction Science 139 (1–4) (junio): 168-181. doi:10.1016/j.anireprosci.2013.04.004.

Variación tiempo-dependiente de la calidad seminal y otros factores asociados

           En la década de los 90, Carlsen et al. llevaron a cabo un meta-análisis que mostró una clara disminución en la calidad espermática del hombre. Esto inició un importante debate científico que ha sido retomado en los últimos años. Los parámetros asociados con la fertilidad masculina, tales como la concentración, motilidad o morfología, han sufrido variaciones que hacen pensar que la calidad seminal ha llegado a un nivel crítico y que en un futuro, la capacidad reproductiva humana podría verse seriamente comprometida.

           Con el fin de corroborar esta afirmación hemos analizado múltiples estudios a nivel mundial realizados en los últimos años para comparar los parámetros de calidad seminal entre América y Europa, tomando como referencia países desarrollados como EEUU (Swan, 2006) y Dinamarca (Jørgensen et al., 2012). Comparamos los datos correspondientes a dichos países en relación al volumen de la muestra obtenida, la concentración espermática, motilidad y morfología, de varones donantes o que habían sido seleccionados de entre la población general por criterios similares a los utilizados en los bancos de semen. La edad de los varones estaba comprendida entre 18 y 40 años, con una media de alrededor de los 30 años. A pesar de que estos trabajos tenían objetivos diferentes y se llevaron a cabo en contextos diferentes, intentamos buscar una relación entre los resultados obtenidos y la variación de la calidad seminal a nivel global en los últimos años.

           El análisis de varones de Dinamarca tomó como referencia la población general de la zona metropolitana de Copenhague entre los años 1996 y 2010. Para la interpretación de los resultados, se compararon con los datos publicados de otro estudio en el área de Copenhague de hombres infértiles examinados entre 1939 y 1943 por el Dr. Hammen (Hammen, 1994). Los resultados obtenidos de estos estudios con respecto a las concentraciones de espermatozoides, recuento total y los porcentajes de espermatozoides morfológicamente normales por cada año de examen se muestran en las siguientes gráficas.

 

     

       Aproximadamente el 42 % de los hombres de la población general tenían concentraciones de espermatozoides por debajo de 40 millones/mL y el 66 % tenía menos de un 9 % de formas normales. El 15 % y el 35 % presentaron una concentración por debajo de los 15 millones/mL y un porcentaje de formas normales inferior al 5 % respectivamente. Se agruparon los resultados del estudio en periodos de 5 años y se vio que los hombres examinados entre los años 2006 y 2010 mostraban una mayor concentración media de espermatozoides, recuento total y número de espermatozoides morfológicamente normales que los hombres examinados entre los años 1996 y 2001. Del mismo modo, los hombres examinados en 2001-2005 parecían tener mejores resultados que los examinados anteriormente. 

       

            De acuerdo a estos datos, que parecen revelar una sutil mejora en los parámetros espermáticos en los últimos 15 años, nuestra hipótesis inicial quedaría anulada. Sin embargo, la comparación de los resultados actuales con los que se tenían de los años 1939-1943 mostró que la población en estudio tenía una concentración y número de espermatozoides totales significativamente inferior a la observada en la década de los 40, lo que corrobora el descenso progresivo de la calidad seminal en las últimas décadas.

            

        

         Según los resultados, parece que los parámetros analizados tienden a disminuir, pero estos datos son insuficientes para poder afirmar que esto afecte de forma global. Por ello, analizamos los resultados obtenidos sobre la calidad espermática en los últimos 70 años en EEUU, concretamente en los estados de Nueva York, Washington, Minnesota, California, Texas y Iowa. Los datos se muestran en las siguientes tablas (Tabla 1 y Tabla 2) (Fisch et al., 1996; Swan, 2006, respectivamente).

          

       Fish et al. hacen un estudio comparativo entre los datos de calidad seminal publicados por otros autores a lo largo del tiempo en diferentes estados de EEUU. Swan compara los datos de concentración espermática entre distintos estados de EEUU en el año 2006.
En relación a los parámetros correspondientes a Nueva York y California, se puede ver una clara disminución en la concentración espermática. Esto permite afirmar de nuevo la existencia de un posible deterioro de la calidad seminal en la actualidad y apoyar la tendencia planteada por Carlsen et al.

          Varios estudios han demostrado que la capacidad de fertilización disminuye si la concentración de espermatozoides es inferior a 40-50 millones/mL o si el porcentaje de espermatozoides normales es inferior al 9 %. En base a los resultados observados de concentración y recuento total, podría esperarse una disminución tiempo-dependiente en la capacidad reproductiva del hombre, pero, no hay datos que apoyen una tendencia similar en el porcentaje de espermatozoides normales por eyaculación. La tendencia puede ser difícil de detectar debido a los diferentes criterios de normalidad que se han aplicado con el paso de los años, y a la gran variabilidad entre el personal evaluador. Sin embargo, cabe destacar la presencia de un bajo porcentaje de espermatozoides de aspecto normal en el eyaculado, por ejemplo un 6,5 % en el caso de la población general danesa (Jørgensen et al., 2011). La misma tendencia fue descrita recientemente en un estudio realizado en Finlandia (Guzick et al., 2001), que también informó de la disminución de la concentración y el recuento de espermatozoides totales.

           Estudios clínicos y prácticos en animales demostraron un importante papel de la morfología espermática en las tasas de concepción (Kruger et al., 1986; Guzick et al., 2001). Estudios de fertilización in vitro en humanos también sugieren un papel importante de la morfología de los espermatozoides para las tasas de fertilización, que se vuelven significativamente más bajas si el porcentaje de espermatozoides normales es inferior al 5 %. En los hombres, el número de espermatozoides morfológicamente normales está generalmente por debajo de 10 % y en los animales sobre el 50 %.

        Se necesitan muchos más estudios de seguimiento para poder afirmar que existe una disminución tiempo-dependiente de la calidad seminal. A pesar de que los análisis comparados tengan objetivos diferentes y se hagan en distintas situaciones geográficas, sí muestran entre sus resultados una disminución de la concentración espermática en los últimos años. Los resultados no son concluyentes y por eso es necesario realizar más estudios de este tipo para poder llegar a una conclusión. Por otro lado, en caso de que la disminución sea real, es importante encontrar las causas que la provoquen, si se trata de un fenómeno biológico real, o una variación simplemente debida al azar. Las posibles causas de esta situación podrían englobar la creciente industrialización y consecuente producción de contaminantes químicos a nivel mundial (López-Teijón et al., 2008), consumo de cafeína (Ramlau-Hansen et al., 2010) o tabaco, índice de masa corporal, tiempo de abstinencia (Swan, 2006) o la presencia de compuestos que puedan actuar como disruptores endocrinos (Yeung et al., 2011), por ejemplo pesticidas u otras sustancias químicas agroalimentarias. Además, estudios recientes señalan como otra posible causa el uso de aparatos electrónicos y dispositivos inalámbricos como el teléfono móvil (Hamada et al., 2011). Este emite ondas electromagnéticas que pueden disminuir la concentración y motilidad progresiva de los espermatozoides y aumentar la proporción de formas anormales. Se ha observado en modelo murino que producen otras alteraciones que afectan a la viabilidad espermática, como la producción de especies reactivas de oxígeno (ROS) o daños en el ADN. Estos factores varían en las distintas zonas geográficas lo que podría explicar las diferencias observadas entre distintas regiones del mundo.

           Es de destacar que sólo una pequeña proporción de la población masculina actual tiene una calidad seminal óptima para la fecundidad según los parámetros de la OMS (Cooper et al., 2010). Sin embargo, un reciente estudio pone en duda si el valor de referencia para la concentración espermática según dicha organización refleja la media real de los varones a nivel mundial (Cardona, 2010). Dicho estudio, llevado a cabo por Walter Cardona, indica que la mayoría de los hombres fértiles presentarían valores de concentración superiores a 65 millones/mL, y sólo el 25 % de la población estaría por debajo de este valor, lo que supondría que el valor de referencia no es el adecuado.

           Sea como fuere, a pesar de no poder afirmar una tendencia negativa con respecto a la evolución de la calidad seminal porque carecemos de los estudios suficientes, sí que podemos ver que según los datos analizados hay una disminución en los últimos 70 años al menos en Dinamarca y EEUU. Son necesarios más estudios que sean realizados en las mismas condiciones y en el mismo contexto para poder llegar a una conclusión clara sobre este tema, así como llevar a cabo análisis que permitan detectar cuáles son las posibles causas de la variación de la calidad espermática.

Bibliografía

1. Calsen E, Giwercman A, Keiding N, Skakkebaek NE. Evidence for decreasing quality of semen during past 50 years. BMJ. 1992; 305 (6854): 609-613.

2. Cardona W. Concentración espermática. ¿Necesitamos un nuevo valor de referencia? Arch. Esp. Urol. 2010; 63 (2): 133-138.

3. Cooper TG, Noonan E, von Eckardstein S, Auger J, Baker HW, Behre HM, Haugen TB, Kruger T, Wang C, Mbizvo MT, Vogelsong KM. World Health Organization reference values for human semen characteristics. Hum Reprod Update. 2010; 16(3): 231-245. doi: 10.1093/ humupd/ dmp048.

4. Fisch H, Ikeguchi EF, Goluboff ET. Worldwide variations in sperm counts. Urology. 1996; 48(6): 909-911.

5. Guzick DS, Overstreet JW, Factor-Litvak P, Brazil CK, Nakajima ST, Coutifaris C, Carson SA, Cisneros P, Steinkampf MP, Hill JA, Xu D, Vogel DL; National Cooperative Reproductive Medicine Network. Sperm morphology, motility, and concentration in fertile and infertile men. N Engl J Med. 2001; 345 (19): 1388-1393.

6. Hamada A, Singh A, Agarwal A. Cell Phones and their Impact on Male Fertility: Fact or Fiction. Open Reprod Sci J. 2011; 5: 125-137.

7. Hammen R. Studies on impaired fertility in man with special reference to the male. Acta Obstet Gynecol Scand. 1944; 24(Suppl3): 1- 205.

8. Jørgensen N, Vierula M, Jacobsen R, Pukkala E, Perheentupa A, Virtanen HE, Skakkebaek NE, Toppari J. Recent adverse trends in semen quality and testis cancer incidence among Finnish men. Int J Androl. 2011; 34(4 Pt 2): e37-48. doi: 10.1111/j.1365-2605.2010.01133.x.

9. Jørgensen N, Joensen UN, Jensen TK, Jensen MB, Almstrup K, Olesen IA, Juul A, Andersson AM, Carlsen E, Petersen JH, Toppari J, Skakkebæk NE.Human semen quality in the new millennium: a prospective cross-sectional population-based study of 4867 men. Reproductive medicine, obstetrics and gynaecology. BMJ Open. 2012; 2: e000990 doi: 10.1136/bmjopen-2012-000990.

10. Kruger TF, Menkveld R, Stander FS, Lombard CJ, Van der Merwe JP, van Zyl JA, Smith K. Sperm morphologic features as a prognostic factor in in vitro fertilization. Fertil Steril. 1986; 46 (6): 1118-1123.

11. López-Teijón M, Elbaile M, Alvarez JG. Geographical differences in semen quality in a population of young healthy volunteers from the different regions of Spain. Andrologia. 2008; 40(5): 318-28. doi: 10.1111/j.1439-0272.2008.00862.x.

12. Ramlau-Hansen CH, Thulstrup AM, Bonde JP, Olsen J, Bech BH. Caffeine intake and semen quality in a population of 2,554 young Danish men. Am J Epidemiol. 2010; 171(12): 1324. doi: 10.1093/aje/kwq161.

13. Swan SH. Semen quality in fertile US men in relation to geographical area and pesticide exposure. Int J Androl. 2006; 29 (1): 105-108.

14. Yeung BH, Wan HT, Law AY, Wong CK. Endocrine disrupting chemical: Multiple effects on testicular signaling and spermatogenesis. Spermatogenesis. 2011; 1 (3): 231-239.

Autores

López Ayala, Juan Antonio

Molinero García, Natalia

Vergaro Varela, Paula